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目的探讨低剂量亚砷酸钠致人支气管上皮(human bronchial epithelial,HBE)细胞恶性转化过程中,细胞氧化还原状态变化情况及Keap1/Nrf2-ARE抗氧化信号通路相关基因表达动态变化趋势,为阐明砷致癌作用的分子机制开辟新的研究途径。方法1.HBE细胞恶性转化鉴定用1μmol/L亚砷酸钠连续染毒HBE细胞,同时设立传代对照组。通过形态学观察、细胞计数法检测生长动力学改变、Elisa法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)以及软琼脂克隆实验鉴定细胞恶性转化情况。2.HBE细胞恶性转化过程中Keap1/Nrf2-ARE信号通路相关指标表达检测将1μmol/L亚砷酸钠染毒组定义为染毒组,将代数匹配对照组定义为传代对照组。建立低剂量亚砷酸钠致HBE细胞恶性转化模型后,分别于暴露1、8、15、22、29、36、43代,以流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,以硫代巴比妥酸(TBA)比色法检测细胞丙二醛(MDA)含量,以WST-1法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力,以Western blot方法检测Keap1/Nrf2-ARE抗氧化通路相关蛋白Nrf2、Keap1及下游基因HO-1蛋白表达情况。3.T-HBE细胞Keap1/Nrf2-ARE通路相关指标表达检测将染砷组软琼脂克隆试验中阳性(≥30个细胞)集落中单个克隆细胞挑出,继续扩大培养,命名为恶性转化的HBE细胞(T-HBE Cells)。再次对T-HBE细胞、传代对照HBE细胞通过上述实验检测ROS、MDA、SOD、Nrf2、Keap1、HO-1表达情况。4.转录因子Nrf2对亚砷酸钠致HBE细胞恶性转化的影响根据上述实验结果,对T-HBE细胞的Nrf2基因进行si RNA转染使其表达沉默,同时设立传代对照组、转染Con si RNA组及T-HBE组作为对照。用Western blot方法检测Nrf2沉默情况,同时检测通路下游基因HO-1表达情况。沉默Nrf2表达后,分别对4组细胞用MTT法检测细胞增殖情况,用划痕实验(Wound-healing cell migration assay)检测细胞迁移情况,用软琼脂克隆(Soft Agar)形成实验检测细胞锚着独立性生长情况。结果1.HBE细胞恶性转化鉴定(1)与传代对照组HBE细胞相比较,染砷组细胞胞核与胞浆分界不清晰,胞浆颜色变得更为浑浊,核仁数量明显增多,细胞边界不光滑,有褶皱,呈浸润型生长。(2)分别取29、36、43代HBE细胞104个接种于24孔板中,于24、48、72、96、120h后计数细胞,结果显示36代HBE细胞生长至96h和120h时,染砷组较传代对照组细胞生长明显加快(p<0.05),43代细胞生长至72h,96h和120h时,染砷组较传代对照组细胞生长明显加快(p<0.05)。43代时,染砷组倍增时间(22.56±0.96 h)较传代对照组细胞(31.41±3.78 h)明显缩短,差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)分别取29、36、43代HBE细胞2×104个检测MMP-9分泌情况,结果显示36代和43代染砷组MMP-9分泌量分别为[(2.651±0.246)ng/ml]、[(2.610±0.242)ng/ml]均较传代对照组显著增多(p<0.05)。(4)43代HBE细胞进行软琼脂克隆实验,结果显示染砷组HBE细胞集落数量为[(273±90)个]明显高于传代对照组[(20±4)个](p<0.05)。2.HBE细胞恶性转化过程中Keap1/Nrf2-ARE信号通路相关指标表达变化HBE细胞染砷至1、8、15、22、29、36、43代,与正常对照(0代)比较,22代及以前HBE细胞内ROS、MDA、SOD水平均呈先升高后下降的波浪形趋势;29代及以后,ROS、MDA水平呈逐渐下降的过低表达状态,且以ROS表现更为明显,而SOD水平在恶性转化后期呈逐渐升高趋势;全细胞、细胞核、细胞浆中HO-1蛋白表达均维持在一个较高水平,且细胞核中HO-1在29代及以后呈现明显升高趋势;全细胞、细胞核中Nrf2蛋白表达在8-22代时开始呈现升高趋势,29代及以后呈现明显持续升高趋势,而细胞浆中Nrf2蛋白表达呈现逐渐下降趋势;全细胞、细胞核、细胞浆中Keap1蛋白表达均呈现逐渐下降趋势,且细胞浆中Keap1蛋白在22代及以后呈现过低表达状态。3.T-HBE细胞Keap1/Nrf2-ARE通路相关指标表达变化分别取T-HBE细胞和传代对照HBE细胞进行检测,结果显示T-HBE细胞中ROS水平、MDA含量均显著降低,SOD活力明显升高,全细胞、细胞核Nrf2蛋白表达均明显升高,细胞浆中Nrf2蛋白表达明显降低(p<0.05),在全细胞、细胞核、细胞浆中Keap1蛋白表达均降低,而HO-1蛋白表达均升高(p<0.05)。4.转录因子Nrf2对亚砷酸钠致HBE细胞恶性转化的影响(1)对恶性转化的T-HBE细胞进行Nrf2 si RNA转染后,结果显示,相较于T-HBE细胞,转染Nrf2 si RNA组细胞和传代对照组HBE细胞中,全细胞、细胞核中Nrf2蛋白表达均降低,全细胞、细胞核中HO-1蛋白表达均降低(p<0.05);(2)传代对照HBE细胞、T-HBE细胞、T-HBE细胞+Nrf2 si RNA、T-HBE细胞+Con si RNA四组细胞用MTT法检测细胞增殖情况,结果显示转染组T-HBE细胞、传代对照HBE细胞的相对细胞增殖率均较T-HBE细胞明显下降(p<0.05);(3)四组细胞划痕实验的结果显示转染组T-HBE细胞迁移率为[(50.7±4.1)%]、传代对照HBE细胞为[(52.1±11.2)%]均较T-HBE细胞[(79.5±7.3)%]显著下降(p<0.05);(4)四组细胞软琼脂克隆实验结果显示转染组T-HBE细胞琼脂中集落数量为[(85±9)个]、传代对照HBE细胞为[(12±7)个]均较T-HBE细胞[(301±29)个]均显著减少(p<0.05)。结论在低剂量亚砷酸钠致HBE细胞恶性转化过程中,Keap1/Nrf2-ARE信号通路被激活,核转录因子Nrf2持续高表达,且可能通过促进细胞增殖参与亚砷酸钠诱导细胞恶性转化。