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赤霉素是一类广泛存在于植物体内的二萜类激素，对植物种子萌发到开花结果的整个生命活动过程都发挥着重要调控作用。对赤霉素的生物合成及信号转导过程相关基因的研究，为上世纪的“绿色革命”中水稻、小麦等粮食作物高产新品种的培育做出了巨大贡献。番茄是全世界广泛种植的重要的蔬菜作物之一，也是研究植物生长发育和果实成熟的重要模式植物。对番茄生长发育调控机理的研究，为促进植株生长、提高果实品质和产量等番茄育种工作具有重要的指导意义。目前，关于番茄赤霉素信号途径相关基因的功能研究，已经使我们对赤霉素调控番茄生长发育的机制有了一定的认识，但仍存在部分赤霉素信号途径相关基因的功能尚未阐明。
本研究首先通过全基因组分析的方法筛选出了可能参与调控番茄果实发育过程和赤霉素信号响应的SlPRE2基因，并以野生型番茄AC作为研究材料，通过转基因技术、定量PCR技术、显微镜观察技术和酵母双杂交等研究方法，从生理生化、分子生物学层面初步探究了SlPRE2在番茄生长发育过程中发挥的生物学功能。同时，本研究以proTALEN突变体为研究材料，通过CRISPR/Cas9系统诱导PROCERA基因突变筛选获得矮化突变体，并对矮化突变体的赤霉素敏感性等特征进行了研究。主要完成了以下几个方面的工作：
① 从番茄基因组中筛选和鉴定了5个拟南芥AtPREs的同源基因，分别命名为SlPRE1-SlPRE5。基因的多序列比对和系统发育分析结果显示，这5个SlPREs均属于非典型bHLH亚家族，且与拟南芥AtPREs基因的同源性较高。利用基因芯片数据分析了SlPREs在番茄多个组织器官中的表达水平，结果发现SlPRE2基因在番茄未成熟果实中特异高表达。构建SlPRE2基因沉默和超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化，获得番茄SlPRE2基因的沉默和超表达转基因株系，并通过定量PCR分析SlPRE2的表达效率。
② 番茄 SlPRE2 沉默株系果实的果实大小、果皮厚度、胎座大小及种子大小均小于野生型。对 SlPRE2 沉默株系番茄果皮组织切片分析表明，SlPRE2 沉默株系中果皮细胞小于野生型。果实细胞膨大和分裂相关基因定量PCR分析结果表明， SlPRE2沉默株系果皮细胞膨大相关基因（SlXTH2和SlXTH5）的表达水平低于野生型。这些结果表明SlPRE2的表达变化能够影响番茄果实的发育过程。
③ 超表达SlPRE2基因使番茄植株节间距增长，叶片卷曲、叶绿素含量降低，并且叶片气孔开度减小。同时，SlPRE2的超表达使番茄未成熟果实的绿色变浅，叶绿素含量降低；成熟果实的红色变浅，果实番茄红素和总类胡萝卜素含量下降。对这些组织中表型相关基因的定量PCR分析表明，SlPRE2超表达株系叶绿素代谢、叶绿体发育和类胡萝卜素合成相关基因的表达受到抑制。透射电镜观察分析表明， SlPRE2超表达果实的叶绿体发育异常。此外，SlPRE2超表达对下胚轴伸长过程具有促进作用。这些结果表明，SlPRE2的超表达能够影响番茄的形态发育和色素代谢。
④ SlPRE2 基因的表达受外源 GA3处理的诱导，说明该基因可能与番茄赤霉素信号途径有关。对SlPRE2沉默株系10DPA时期果实的赤霉素代谢和响应相关基因检测也表明，SlPRE2 的表达变化能够对果实赤霉素代谢途径产生影响。对SlPRE2超表达和沉默株系的GA3和PAC处理实验表明，SlPRE2超表达和沉默株系在叶片叶绿素积累和植株高度增长方面具有相反的PAC敏感性，SlPRE2的表达能够提高植物对多效唑的抗性。SlPRE2超表达株系在PAC处理后的GA代谢相关基因检测结果表明，SlPRE2的超表达能够影响植株对PAC的响应。这些结果表明， SlPRE2基因参与番茄植株赤霉素响应调控并影响赤霉素代谢基因表达。
⑤ 构建了proTALEN1和proTALEN7位点特异的CRISPR/Cas9 基因编辑载体，使用农杆菌介导的遗传转化将构建的 CRISPR/Cas9 系统转入番茄，并通过组培苗矮化植株筛选和PCR检测NPTⅡ基因确定获得13个转基因株系。通过对杂交可育的8号和9号株系的靶位点DNA测序和PCR产物酶切分析，结果发现所获得的两个株系均在靶位点发生 1 个插入和 1 个删除突变，其中等位基因 PROGF8 和PROGF9分别在proTALEN1和proTALEN7突变基础上发生单碱基插入，恢复DELLA编码阅读框；等位基因proLF8和proLF9分别在proTALEN1和proTALEN7基础上发生6个和1个碱基删除，未恢复DELLA编码阅读框。
⑥ 对 PROGF8和 PRO 的 DELLA 结构域结构预测分析结果显示，PROGF8的LExLE基序与GID1的侧链残基之间的作用受到破坏，LExLE基序与TVHYNP基序之间区域由于多个氨基酸的插入而变得结构紊乱，可能对 DELLA 结构域与GID1之间的蛋白互作造成影响。通过对PROGF8突变体植株的外源GA3和PAC处理，结果表明PROGF8突变体对GA3具有显著降低的敏感性。离体花粉萌发实验和遗传杂交实验研究表明，PROGF8突变体花粉发育异常，花粉活性下降。对储存 4个月的和新鲜PROGF8种子的萌发活性研究表明，PROGF8基因对番茄种子萌发过程具有抑制作用，且对新鲜种子的萌发具有半显性调控作用。
综上所述，本研究从番茄中筛选出5个SlPREs基因且对SlPRE2在番茄植株形态建成、果实发育调控和赤霉素信号途径中发挥的作用进行了研究；并通过CRISPR/Cas9 系统基因编辑获得了赤霉素敏感性极低，花粉、种子萌发活性下降的PROGF8矮化突变体。对这两个基因功能的研究，为进一步阐明番茄中受赤霉素途径影响的生长发育调控机制奠定了基础。
本研究首先通过全基因组分析的方法筛选出了可能参与调控番茄果实发育过程和赤霉素信号响应的SlPRE2基因，并以野生型番茄AC作为研究材料，通过转基因技术、定量PCR技术、显微镜观察技术和酵母双杂交等研究方法，从生理生化、分子生物学层面初步探究了SlPRE2在番茄生长发育过程中发挥的生物学功能。同时，本研究以proTALEN突变体为研究材料，通过CRISPR/Cas9系统诱导PROCERA基因突变筛选获得矮化突变体，并对矮化突变体的赤霉素敏感性等特征进行了研究。主要完成了以下几个方面的工作：
① 从番茄基因组中筛选和鉴定了5个拟南芥AtPREs的同源基因，分别命名为SlPRE1-SlPRE5。基因的多序列比对和系统发育分析结果显示，这5个SlPREs均属于非典型bHLH亚家族，且与拟南芥AtPREs基因的同源性较高。利用基因芯片数据分析了SlPREs在番茄多个组织器官中的表达水平，结果发现SlPRE2基因在番茄未成熟果实中特异高表达。构建SlPRE2基因沉默和超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化，获得番茄SlPRE2基因的沉默和超表达转基因株系，并通过定量PCR分析SlPRE2的表达效率。
② 番茄 SlPRE2 沉默株系果实的果实大小、果皮厚度、胎座大小及种子大小均小于野生型。对 SlPRE2 沉默株系番茄果皮组织切片分析表明，SlPRE2 沉默株系中果皮细胞小于野生型。果实细胞膨大和分裂相关基因定量PCR分析结果表明， SlPRE2沉默株系果皮细胞膨大相关基因（SlXTH2和SlXTH5）的表达水平低于野生型。这些结果表明SlPRE2的表达变化能够影响番茄果实的发育过程。
③ 超表达SlPRE2基因使番茄植株节间距增长，叶片卷曲、叶绿素含量降低，并且叶片气孔开度减小。同时，SlPRE2的超表达使番茄未成熟果实的绿色变浅，叶绿素含量降低；成熟果实的红色变浅，果实番茄红素和总类胡萝卜素含量下降。对这些组织中表型相关基因的定量PCR分析表明，SlPRE2超表达株系叶绿素代谢、叶绿体发育和类胡萝卜素合成相关基因的表达受到抑制。透射电镜观察分析表明， SlPRE2超表达果实的叶绿体发育异常。此外，SlPRE2超表达对下胚轴伸长过程具有促进作用。这些结果表明，SlPRE2的超表达能够影响番茄的形态发育和色素代谢。
④ SlPRE2 基因的表达受外源 GA3处理的诱导，说明该基因可能与番茄赤霉素信号途径有关。对SlPRE2沉默株系10DPA时期果实的赤霉素代谢和响应相关基因检测也表明，SlPRE2 的表达变化能够对果实赤霉素代谢途径产生影响。对SlPRE2超表达和沉默株系的GA3和PAC处理实验表明，SlPRE2超表达和沉默株系在叶片叶绿素积累和植株高度增长方面具有相反的PAC敏感性，SlPRE2的表达能够提高植物对多效唑的抗性。SlPRE2超表达株系在PAC处理后的GA代谢相关基因检测结果表明，SlPRE2的超表达能够影响植株对PAC的响应。这些结果表明， SlPRE2基因参与番茄植株赤霉素响应调控并影响赤霉素代谢基因表达。
⑤ 构建了proTALEN1和proTALEN7位点特异的CRISPR/Cas9 基因编辑载体，使用农杆菌介导的遗传转化将构建的 CRISPR/Cas9 系统转入番茄，并通过组培苗矮化植株筛选和PCR检测NPTⅡ基因确定获得13个转基因株系。通过对杂交可育的8号和9号株系的靶位点DNA测序和PCR产物酶切分析，结果发现所获得的两个株系均在靶位点发生 1 个插入和 1 个删除突变，其中等位基因 PROGF8 和PROGF9分别在proTALEN1和proTALEN7突变基础上发生单碱基插入，恢复DELLA编码阅读框；等位基因proLF8和proLF9分别在proTALEN1和proTALEN7基础上发生6个和1个碱基删除，未恢复DELLA编码阅读框。
⑥ 对 PROGF8和 PRO 的 DELLA 结构域结构预测分析结果显示，PROGF8的LExLE基序与GID1的侧链残基之间的作用受到破坏，LExLE基序与TVHYNP基序之间区域由于多个氨基酸的插入而变得结构紊乱，可能对 DELLA 结构域与GID1之间的蛋白互作造成影响。通过对PROGF8突变体植株的外源GA3和PAC处理，结果表明PROGF8突变体对GA3具有显著降低的敏感性。离体花粉萌发实验和遗传杂交实验研究表明，PROGF8突变体花粉发育异常，花粉活性下降。对储存 4个月的和新鲜PROGF8种子的萌发活性研究表明，PROGF8基因对番茄种子萌发过程具有抑制作用，且对新鲜种子的萌发具有半显性调控作用。
综上所述，本研究从番茄中筛选出5个SlPREs基因且对SlPRE2在番茄植株形态建成、果实发育调控和赤霉素信号途径中发挥的作用进行了研究；并通过CRISPR/Cas9 系统基因编辑获得了赤霉素敏感性极低，花粉、种子萌发活性下降的PROGF8矮化突变体。对这两个基因功能的研究，为进一步阐明番茄中受赤霉素途径影响的生长发育调控机制奠定了基础。