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溃疡病是杨树枝干上的重大病害,是国内外林木上的重大生物灾害,基于内生细菌发展生物制剂来控制杨树溃疡病较传统的化学防治更有前途;而物种的最终鉴定也是至关重要的,因为生物防治以及植物自身促生物质包括抗细菌、抗真菌的多肽类,胞外植酸酶、几丁质酶的合成都具是菌株特异性。本研究所采用的分子鉴定手段有利于杨树内生细菌近缘种的鉴定;同时利用生物信息学方法研究了解淀粉芽孢杆菌TasA基因的特性,原核表达出TasA融合蛋白。本研究包括以下三部分:(1)杨树内生细菌的分子鉴定对从杨树水泡溃疡病斑处分离筛选得到的15株杨树内生细菌进行了16S rRNA测序,经序列比对鉴定其分别属于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。结合Genbank中其它芽孢杆菌16S rRNA的序列分析发现,16S rRNA对区别和鉴定亲缘距离较远的杨树内生芽孢杆菌是简便和正确的,但对于亲缘关系较近的物种却存在一定不足;而芽孢杆菌16S rRNA在核酸115-485存在高变区,202、285、465、472、483五个位点的碱基多态性,有益于杨树内生细菌的分子鉴定,对芽孢杆菌属细菌的分子鉴定也是一个有益补充。而基于多态位点选取的Fnu4H I、Rsa I、Taq I 3种内切酶中的任何一种的酶切图谱可同时鉴定B. megaterium、B. amyloliquefaciens、B. subtilis以及B. cereus。TasA及其类似基因序列比对发现,B. amyloliquefaciens同B. subtilis核酸序列的同源性为74%,氨基酸序列的同源性也仅为80%左右,说明TasA序列分析可以作为芽孢杆菌分类鉴定的一种辅助手段。(2)解淀粉芽孢杆菌PEBA20 TasA功能基因的序列分析TasA基因ORF全长786bp,共编码了261个氨基酸,分子量为28.123KD,等电点为6.82;该基因在GenBank中注册的登记号为FJ718530。解淀粉芽孢杆菌PEBA20 TasA蛋白的信号肽区位于分泌蛋白TasA的N端,由27个氨基酸组成。通过氨基酸组成分析可发现:一些疏水氨基酸所占比例较大,连续几个疏水氨基酸在信号肽区组成了疏水核心。TasA蛋白的跨膜区域也集中在氨基酸序列3-30,长度为28aa。而在整个二级结构中,有54个氨基酸残基为ɑ-螺旋,占20.6%;有63个氨基酸残基为?-折叠股,占24.0%;有145个氨基酸残基为无规则卷曲,占55.3%。(3)TasA融合蛋白原核表达成功构建了的重组表达质粒pEASY-E1/TasA,并转入表达菌株BL21,利用IPTG诱导,融合蛋白得到正确表达,且25℃较37℃更有利于诱导重组蛋白的表达。