纤维质原料二步发酵生产L-乳酸

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近几年,全球的能源危机和环境问题激励着研究者们寻求绿色环保的工业产品生产技术。其中,利用廉价农作物下脚料合成L-乳酸吸引了世界范围内研究者的兴趣。另外L-乳酸可聚合形成聚乳酸(PLA)从而取代以石油原料为主的塑料产品。然而由于L-乳酸的昂贵价格导致PLA的大规模应用受到限制。因此通过利用廉价原料并提高L-乳酸产量和产率来降低其生产成本意义重大。目前,导致L-乳酸生产成本较高的瓶颈问题主要有下列几个方面:一是生产原料的高成本;二是木质纤维质原料难以降解导致水解液中还原糖浓度低;三是微生物生长所需的氮源、生长因子以及乳酸发酵过程酸中和剂如碳酸钙的成本。本研究以农作物下脚料蔗渣为原料,采用物理化学联合预处理方法对原料进行预处理。利用紫外等复合诱变技术筛选L-乳酸高产菌株。论文采用黑曲霉发酵获得高活性的纤维素酶和木聚糖酶,经酶解预处理的蔗渣原料获得糖化液,作为第二步发酵菌株干酪乳杆菌产L-乳酸的碳源,探索了利用廉价原料生产L-乳酸新途径。主要研究包括以下几个方面:(1)纤维质原料的真菌发酵产酶研究。通过对蔗渣的黑曲霉发酵接种量、发酵培养基固液比(蔗渣质量:营养液体积)、温度、时间进行优化。结果表明黑曲霉发酵接种量为6%,发酵培养基固液比为1:10,在30℃下固体发酵76h条件下能够获得较高的纤维素酶和木聚糖酶活性。(2)纤维质原料的预处理工艺研究。为了提高蔗渣糖化率,考察发现预处理最佳NaOH质量分数为0.5%,用量为2ml/g蔗渣,置于45℃环境中每隔4h喷洒揉搓,12h后利用0.1mol/L盐酸溶液中和,发现经过稀碱揉搓处理的蔗渣降解得到的还原糖量比未处理蔗渣提高了65.6%。(3)纤维质原料的酶解工艺研究。通过单因素实验和二次回归正交实验方法,对原料蔗渣的酶解糖化过程进行优化,确定了最佳糖化条件为底物浓度8%,pH4.3,添加6.9ml粗酶液后于43.9℃环境中酶解14h,最后得到糖化液还原糖浓度达到54g/L。(4)复合诱变选育高产L-乳酸菌株研究。采用紫外线、硫酸二乙酯对干酪乳杆菌进行复合诱变,并利用蔗渣糖化液培养基对其进行驯化筛选。结果发现,紫外线最佳诱变时间为25s;硫酸二乙酯的最佳处理参数为1%的硫酸二乙酯处理20min,在上述参数下对试验菌株进行反复诱变选育,得到一株稳定的高产菌株NE-19,其产酸量达到57g/L,这与原始菌株(乳酸产量42.5g/L)的产酸量相比提高了34.1%。(5)突变株酶解液发酵工艺研究。通过对高产突变株NE-19培养基及培养工艺进行优化,得到最佳接种量为10%,初始pH为6.7,碳酸钙添加量为45.5g/L,还原糖浓度为110g/L,蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、无水乙酸钠、MgSO47H2O和MnSO47H2O加入量分别为1.5%、0.5%、0.4%、2.2g/L、0.15g/L、0.075g/L,最佳发酵温度为41℃,发酵120h后突变株NE-19的乳酸产量达到70.2g/L,比出发菌株(53g/L)提高了32.4%,比优化前乳酸产量(57g/L)提高了23.2%。
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