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鸭坦布苏病毒病是一种近年新发的鸭感染性疾病,被感染的鸭群首先表现为采食量下降,接踵而至的是产蛋量下降,到发病第10天,产蛋量能降至平常产蛋量的10%以内,该病死亡率在5-30%。其致病原鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)属于黄病毒科黄病毒属单股正链RNA病毒,除了能严重影响产蛋鸭、种鸭的生产性能外,还能感染肉鸭、鹅、鸡、麻雀、野鸟、蚊子甚至小鼠等。由于其传播速度快,传播途径尚不明了,感染宿主范围广,以及缺乏足够有效的药物进行及时治疗,已经严重危害着我国水禽业的健康发展和人类公共卫生安全。本研究采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)蛋白质组学技术首次研究分析了DTMUV感染乳仓鼠肾(baby hamster kidney,BHK-21)细胞前后的差异表达蛋白,并且研究了DDX3X对DTMUV复制的影响。为更好地防控该病提供理论指导。具体研究内容如下:1.DTMUV感染BHK-21细胞的蛋白质组学分析为了研究DTMUV感染后宿主细胞蛋白表达变化的情况,本研究采用iTRAQ技术,并与高通量双向高效液相色谱质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)联用对DTMUV感染BHK-21细胞后24h和48h两个时间点的蛋白表达情况进行了检测和分析。共鉴定到192个差异表达的宿主蛋白。与对照相比,DTMUV感染后24h,有11个显著上调表达蛋白和8个显著下调表达蛋白;DTMUV感染后48h,有25个显著上调表达蛋白151个显著下调表达蛋白。对差异表达蛋白进行包括基因本体论(Gene Ontology,GO)分析,京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,蛋白互作网络等生物信息学分析,结果表明细胞内的差异表达蛋白涉及多个生物学过程、细胞组分和分子功能等,且随着DTMUV的不断复制,感染后48h的蛋白变化明显多于感染后24h。因此选择感染后48h的差异表达蛋白作进一步IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis)分析和验证。在所有差异表达蛋白当中,Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)上调倍数最大,IPA分析其属于抗微生物感染免疫蛋白互作网络里的蛋白,而同在一个互作网络里的RNA解旋酶DDX3X(DEAD-box helicase 3,X-linked)及其家族成员DDX5则下调表达。为了验证蛋白质组学结果的可靠性,进一步通过荧光定量qRT-PCR和Western blot实验对TLR9、DDX3X和DDX5的表达进行了检测,结果与蛋白质组学结果一致。说明TLR9、DDX3X和DDX5可能参与了DTMUV的复制。2.DDX3X对DTMUV复制的影响为研究DDX3X对DTMUV复制的影响,本研究从BHK-21细胞中克隆DDX3X基因并成功构建真核表达质粒3Flag-DDX3X。通过在BHK-21细胞中过表达或干扰DDX3X后用DTMUV感染细胞并检测病毒复制水平,结果表明过表达DDX3X能抑制病毒的增殖,而干扰DDX3X则能促进病毒的增殖。而有报道人源DDX3X参与多种病毒的复制过程,在人胚胎肾(human embryonic kidney,HEK293T)细胞内能通过作用于TBK1调控Ⅰ干扰素通路而抑制同为黄病毒科的登革病毒(Dengue virus,DENV)的复制,为了确定BHK-21细胞内DDX3X是否也有类似作用,本研究采用聚肌胞苷酸poly(I:C)刺激BHK-21细胞,然后用绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein,VSV-GFP)感染细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞计数的方法证明了细胞内干扰素通路的存在。并且比对了人源和仓鼠源的DDX3X的氨基酸序列,发现其相似度高达98.3%,接着将3Flag-DDX3X与人源TBK1基因真核表达质粒HA-TBK1同时转染HEK293T细胞,通过免疫共沉淀检测发现,仓鼠源DDX3X能够与TBK1发生相互作用,进而又通过双荧光素酶报告系统检测了二者对β干扰素(Interferon-beta,IFN-β)启动子活性的影响。与对照或单独转染HA-TBK1实验组相比,仓鼠源DDX3X明显促进了IFN-β启动子活性,说明仓鼠源DDX3X能增强TBK1对IFN-β启动子的诱导。用同样的方法处理HEK293T细胞,并用Trizol Reagent裂解细胞收取细胞总RNA,用荧光定量qRT-PCR检测了在HEK293T细胞中IFN-β及下游基因的mRNA变化。结果显示,同时转染HA-TBK1和3Flag-DDX3X明显促进了IFN-β及下游STAT1、OAS、Mx1、ISG15、ISG56基因的mRNA转录。进一步证实了仓鼠源DDX3X能通过TBK1增强对IFN-β的诱导,与人源DDX3X有相似功能。