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背景和目的：幽门螺杆菌(Hp)是多种消化系疾病的病原体,其致病多样性可能和Hp对胃上皮细胞凋亡及胃上皮细胞增殖的影响密切相关。Hp感染可引起胃上皮细胞活性氧(ROS)升高及DNA损伤,ROS是生物体内需氧细胞在代谢过程中产生的一系列衍生物,参与和影响细胞信号转导等一系列生物学作用。Hp同时亦可激活PI3K/Akt信号通路发挥抗凋亡作用,但随着PI3K信号通路的激活,Hp对胃上皮细胞的作用主要表现为促凋亡,这可能与Akt的激活也可增加ROS的水平有关,因而我们设想Hp激活胃上皮细胞Akt信号通路时,决定细胞增殖或凋亡的命运和ROS的水平密切相关,可能起关键作用。Hp作用GES-1细胞后ROS的水平与PI3K/Akt信号通路之间的关系尚不明确。因此我们以Hp感染GES-1细胞,并使用PI3K信号通路抑制剂Ly294002及N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制ROS的生成,通过检测ROS的变化、DNA损伤及Akt信号通路蛋白的表达,以探讨可能的相关分子机制。方法：1、细胞培养：GES-1细胞培养液含10%的胎牛血清、2%的青链霉素、HyClone高糖DMEM培养基,在Hp感染GES-1细胞前,细胞培养基换用无抗生素的含10%胎牛血清的高糖DMEM进行培养。2、幽门螺杆菌的培养和活菌悬液制备：选择Hp标准菌株菌株ACTC43504(CagA+,VacA+),在含10%羊血的固体琼脂板培养3天,制备Hp活菌悬液,并进行鉴定。3、Hp感染GES-1细胞模型的建立：用对数生长期的Hp感染GES-1细胞,(1)预实验部分：设计空白对照组(0,1h,3h,6h,12h),3h MOI(0:1,25:1,50:1,100:1,200:1,300:1),6h MOI100:1(0,Hp+GES-1,Hp+DMSO+GES-1, Hp+Ly294002+GES-1,Hp+NAC+GES-1)；(2)取细菌细胞比(MOI100：1),Hp感染GES-1细胞0.1h、3h、6h、12h;(3)取细菌细胞比MOI0:1.25:1.50:1、100：1、200：1、300：1,感染GES-1细胞6h。(4)设计6h MOI300:1(0, Hp+GES-1,Hp+DMSO+GES-1,Hp+Ly294002+GES-1,Hp+NAC+GES-1)；4、细胞内ROS水平检测：NAC预处理GES-11h,然后Hp感染GES-16h时,通过装载荧光探针DCFH-DA进入GES-1细胞内,分别通过活细胞工作站观察细胞内ROS变化和多功能酶标仪定量检测细胞内ROS含量。5、PI3K/Akt信号通路蛋白表达的检测：在Hp、Ly294002、NAC、DMSO等因素处理后,通过Western BlOt方法进行蛋白测定。6、DNA损伤检测：通过ROS清除剂NAC预处理GES-1细胞,在MOI300：1浓度感染GES-16h后,采用凯基彗星实验法(单细胞凝胶电泳)检测DNA损伤。结果：(1)NAC对Hp感染GES-1细胞内ROS水平的影响：通过使用多功能荧光酶标仪对ROS进行定量检测发现,ROS的含量与Hp的作用浓度呈正比,至MOI300：1时ROS含量最高,各浓度NAC均可显著抑制ROS的生成,与对照组相比,差异具有统计学意义。(2)不同药物预处理GES-1细胞后,对Hp感染GES-1细胞内Akt信号通路蛋白的表达的影响：A.在空白对照组,Akt信号通路蛋白(Akt、p-Akt308、 GSK3-β、p-GSK3-β)的表达并不会随时间而发生改变；B.在6h时,总蛋白Akt和GSK3-β并不会随Hp浓度的增加而改变,差异无统计学意义(P>0.05)；p-Akt不p-GSK3-β的表达则随Hp作用浓度的增加而增加,差异有统计学意义(p<0.05)；C.在MOI100：1时,p-Akt、p-GSK3-β的表达与Hp的作用时间呈正比,且差异均有统计学意义(P<0.05)；D.在Ly294002预处理后,明显的抑制了p-Akt、 p-GSK3-β的表达,与Hp组相比差异具有统计学意义(P<0.05),Hp组与DMSO组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)；在NAC预处理后,p-Akt、p-GSK3-β的表达比Hp组有明显的降低,差异有统计学意义(P<0.05),Hp组与DMSO组的相比,差异无统计学意义(p>0.05)。(3)不同药物预处理GES-1细胞后,对Hp感染GES-1细胞DNA损伤的影响：Hp组GES-1的彗星尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩数值均较对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)；DMSO预处理后,有关DNA损伤指标的数据有所下降,但与Hp组相比差异无统计学意义(P<0.05)；而NAC预处理后,GES-1的尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩数值均较Hp组有明显下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：通过体外实验表明,Hp作用GES-1细胞后,可使ROS生成增多,损伤DNA。Hp感染同时可激活Akt信号通路。抑制ROS的生成可减轻Hp感染导致的DNA损伤,并可减弱Akt信号通路蛋白的激活。在Hp感染过程中,ROS水平和Akt信号通路的激活密切相关。