乳腺肿瘤是母犬发病率较高的肿瘤性疾病。目前临床上多采取外科手术切除联合化学药物治疗的手段,良性肿瘤一般预后良好,但恶性肿瘤常预后不良并导致宠物死亡。浸润和转移是恶性肿瘤的重要特征,也是导致患犬预后不良和死亡的主要原因。因此,寻找灵敏度高、特异性强的犬乳腺肿瘤预后标志物对准确评估患犬的预后情况、及时确定最有效的治疗方案、控制肿瘤转移转恶具有重要的临床意义。本实验通过高通量测序技术对3例犬乳腺癌组织及其癌旁组织的mRNA进行测序分析,通过GO功能分析和KEGG Pathway分析筛选与犬乳腺癌转移相关的差异表达mRNA。采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)对挑选出来的转移相关差异表达mRNA进行验证,同时检测其在体外培养的原发灶细胞株(CHMp)和转移灶细胞株(CHMm)中的表达量。同时,采用免疫组织化学技术检测由PTPN1基因编码的PTP1B蛋白在犬乳腺癌组织和健康犬乳腺组织中的表达情况,并构建了PTPN1真核表达重组质粒以进一步探究PTPN1基因在肿瘤细胞信号转导中的作用机制。转录组测序结果显示,在犬乳腺癌和癌旁组织中共筛选到2208个差异表达mRNA,其中上调1459个,下调749个。通过KEGG信号通路、GO功能分析筛选出与犬乳腺癌浸润和转移相关的差异表达mRNA,包括PAI-1、PTPN1、VEGFC、VCAM1、ICAM1,主要在细胞迁移、细胞成分运动、细胞黏附等过程并且在缺氧诱导因子-1信号通路、黏合连接信号通路、血管内皮生长因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路中发挥作用,提示这些差异表达mRNA在肿瘤浸润和转移过程中发挥着重要的作用。RT-qPCR结果显示,犬乳腺癌组织和癌旁组织中的PAI-1、VEGFC、PTPN1、VCAM1、ICAM1基因表达差异倍数和变化趋势与转录组测序结果一致,其中PAI-1和VEGFC基因表达量与对照组相比差异显著,PTPN1、VCAM1和ICAM1基因表达量与对照组相比差异不显著。将临床收集的犬乳腺肿瘤样品通过病理组织学检测结果分为恶性肿瘤组和良性肿瘤组,分别取病变位置的组织和对应的病变周围组织并采用RT-qPCR的方法检测PAI-1、PTPN1、VEGFC、VCAM1、ICAM1基因的表达水平。实验结果表明,PAI-1、PTPN1、VEGFC基因在恶性肿瘤和良性肿瘤中均高表达,但是病变位置组织和对应的病变周围组织相比未有显著差异;VCAM1基因在恶性肿瘤和良性肿瘤中均显著低表达,提示VCAM1与犬乳腺肿瘤的发生和发展等过程相关;ICAM1基因仅在恶性肿瘤中显著低表达,这种低表达在良性肿瘤中未出现显著差异,提示ICAM1可能作为鉴别犬乳腺肿瘤良恶性的潜在分子标记。为进一步明确这五个基因在犬乳腺肿瘤转移中的作用,对犬乳腺肿瘤细胞系CHMp和CHMm进行RT-qPCR,结果显示转移灶的CHMm细胞中的ICAM1基因表达量与CHMp细胞相比差异显著,PAI-1、PTPN1、VEGFC、VCAM1基因表达量与CHMp细胞相比均无显著差异,进一步说明ICAM1基因参与了犬乳腺肿瘤的浸润、转移过程。综上所述:ICAM1可作为犬乳腺肿瘤预后评估的潜在分子标志物。在临床上,通过分子生物学的方法检测基因的表达量变化会相对繁琐,而蛋白质是生物体内各种功能的执行者,相比于基因,可以更加直接地反映功能机制,并且通过免疫学的方法检测蛋白含量的变化更加方便快捷。高通量测序技术可以在全基因组范围内搜寻与犬乳腺肿瘤转移相关的mRNA,再通过表达量显著变化的mRNA找到在肿瘤转移过程中有变化和作用的蛋白质,本研究的GO功能分析和KEGG信号通路分析显示,PTPN1基因主要是通过其编码的PTP1B蛋白的去磷酸化作用来参与犬乳腺肿瘤细胞黏附进程的,可推测PTP1B与犬乳腺肿瘤的浸润、转移过程相关;本研究中通过RT-qPCR检测,PTPN1基因在犬乳腺肿瘤组织中高表达但与肿瘤周围的非肿瘤组织相比未有显著差异,推测PTP1B的作用与其酪氨酸磷酸酶活性有一定的相关性,少量表达的酪氨酸磷酸酶1B即可对肿瘤的浸润、转移产生影响。为了探究PTP1B在犬乳腺肿瘤中的表达水平以及蛋白酪氨酸磷酸酶1B参与犬乳腺肿瘤浸润、转移过程的具体分子机制,对采集的犬乳腺癌组织和健康组织进行免疫组化分析并构建了PTPN1的重组表达质粒。免疫组化结果显示:PTP1B蛋白在犬乳腺癌组织和健康犬乳腺组织中均低表达且PTP1B蛋白在犬乳腺癌组织中的表达量高于健康犬乳腺组织中的表达量,提示PTP1B蛋白在犬乳腺肿瘤浸润、转移过程发挥作用的主要因素是其酪氨酸磷酸酶活性。本实验筛选了与犬乳腺肿瘤转移相关的mRNA并对其进行了验证分析,为解读犬乳腺肿瘤浸润、转移的机制,寻找潜在的预后标志物和分子治疗靶点提供了一定的依据。