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目的:职业和环境有害因素导致糖尿病患病率增加。糖尿病患者在工作中接触某职业有害因素后,其并发症的发病率显著增加。糖尿病肾病是糖尿病严重并发症之一。肾小管病变与肾功能损伤及其预后具有很高的相关性。在糖尿病肾病早期,肾小管先于肾小球发生病变。脂质蓄积和炎症是糖尿病肾病发生发展中的重要病理状态。本课题组前期研究发现,维生素D的活性形式1,25二羟基维生素D3(1α,25(OH)2D3)对糖尿病肾病具有一定保护作用。另外,维生素D能否通过抑制脂质蓄积、减轻炎症从而缓解糖尿病肾病尚未明确,其潜在机制仍需进一步探究。本研究以大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)及人肾小管上皮细胞(HK-2)为体外模型,探讨维生素D对高糖所致肾小管上皮细胞脂质蓄积和炎症的影响及其可能机制,为临床糖尿病肾病的防治提供新思路。方法:本研究分为四个部分。(1)探究高糖对肾小管上皮细胞脂代谢的影响:用高糖培养基培养肾小管上皮细胞,培养不同时间(0h、3 h、6 h、12 h、24h、48 h)后,通过油红O染色、胞内甘油三酯和胆固醇含量测定,确定高糖对肾小管上皮细胞脂代谢的影响及时间效应。(2)维生素D对高糖所致肾小管上皮细胞脂代谢的影响:CCK-8检测1α,25(OH)2D3、250HD及高糖(葡萄糖浓度为30 mmol/L)对肾小管上皮细胞活力的影响;油红O染色分析1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)和250HD(10nM、100 nM)对高糖所致肾小管上皮细胞脂质蓄积的影响;血生化分析仪分析1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)和 250HD(10 nM、100 nM)对高糖处理下肾小管上皮细胞脂质外流的影响;Western blotting检测SCAP-SREBPs通路蛋白SCAP和SREBP2以及VDR表达水平的变化,分析并比较1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)和250HD(10nM、100nM)对高糖所致肾小管上皮细胞胞内胆固醇合成的影响。(3)1α,25(OH)2D3通过调节SCAP-SREBPs通路抑制高糖所致肾小管上皮细胞脂质蓄积:使用流式细胞仪、CCK-8实验分别检测1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)、高糖和两者联合处理对肾小管上皮细胞活力、凋亡率的影响;采用油红O染色及胞内甘油三酯、胆固醇含量检测,分析1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)、高糖和两者联合处理对肾小管上皮细胞内脂质蓄积的影响;运用酶标仪、血生化分析仪分析1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)、高糖和两者联合处理对肾小管上皮细胞脂质氧化、脂质外流的影响;采用 Reαl-time qPCR、Western blotting 实验,检测 SCAP-SREBPs 通路因子 SCAP、SREBP-1c、SREBP2、FASN、HMGCR 表达水平的变化,分析 1α,25(OH)2D3(10nM、100nM)、高糖和两者联合处理对肾小管上皮细胞胞内甘油三酯、胆固醇合成的影响。(4)1α,25(OH)2D3对高糖所致肾小管上皮细胞炎症的影响:Real-time qPCR检测炎症因子相关基因TGF-β1、IL-6表达水平的变化,分析高糖能否引起细胞炎症,1α,25(OH)2D3(10nM、100nM)对高糖所致炎症是否具有保护作用。结果:1.高糖培养(30 mmol/L)24 h后,HK-2细胞、NRK-52E细胞内脂滴均显著增多,同时甘油三酯、胆固醇含量也显著增加;当培养48h后,HK-2细胞、NRK-52E细胞内的脂滴、甘油三酯、胆固醇增多更加明显。2.(1)1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)和 250HD(10 nM、100nM)分别与高糖联合处理后(48 h),NRK-52E细胞活力没有改变。(2)1α,25(OH)2D3(10nM、100 nM)和250HD(10 nM、100 nM)减少了 NRK-52E细胞由高糖引起的脂滴增多。(3)1α,25(OH)2D3(10nM、100nM)和 250HD(10nM、100 nM)分别与高糖联合处理后(48 h),NRK-52E细胞的脂质外流没有发生改变,具体表现为胞外甘油三酯、胆固醇含量没有发生显著变化。(4)1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)和250HD(10 nM、100nM)处理显著抑制了 NEK-52E细胞由高糖引起的胆固醇合成相关蛋白表达的升高。1α,25(OH)2D3和250HD处理提高了 NRK-52E细胞VDR蛋白表达水平。3.(1)1α,25(OH)2D3(10nM、100 nM)、高糖及两者联合处理后(24h、48 h),HK-2细胞的活力没有发生显著变化;但是1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)和高糖单独处理降低了 NRK-52E细胞的活力。1α,25(OH)2D3处理改善了由高糖引起的NRK-52E细胞活力的降低。(2)1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)、高糖及两者联合处理24h后,HK-2细胞、NRK-52E细胞的凋亡率没有发生显著变化;处理48h后,NRK-52E细胞的凋亡率没有发生显著变化。而在HK-2细胞中,高糖处理组凋亡率显著高于对照组,且1α,25(OH)2D3(10nM、100 nM)处理降低了由高糖引起的凋亡率升高,此效果具有剂量-效应关系。(3)1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)、高糖分别单独处理后(24h、48 h),HK-2细胞和NRK-52E细胞内脂滴显著增多,具体表现为甘油三酯、胆固醇含量增多;而在1α,25(OH)2D3、高糖联合处理组中,1α,25(OH)2D3处理减少了 HK-2细胞和NRK-52E细胞由高糖引起的脂滴增多,具体表现为减少细胞内甘油三酯、胆固醇含量。此效果具有剂量-效应关系。(4)1α,25(OH)2D3(10nM、100 nM)、高糖及两者联合处理后(24h、48 h),HK-2细胞和NRK-52E细胞的脂质氧化水平均没有发生显著变化。(5)1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)、高糖及两者联合处理后(24 h、48 h),HK-2细胞和NRK-52E细胞的脂质外流均没有发生显著变化,具体表现为胞外甘油三酯、胆固醇含量不发生显著变化。(6)1α,25(OH)2D3通过SCAP-SREBPs通路调节肾小管上皮细胞的脂代谢。1α,25(OH)2D3(10nM、100 nM)、高糖处理(24 h、48 h)显著增加了 HK-2细胞和NRK-52E细胞中甘油三酯、胆固醇合成相关基因的表达;但是两者联合处理组的甘油三酯、胆固醇合成相关基因的表达水平较对照组有所下降。4.高糖处理后(24 h、48 h),HK-2细胞内的炎症因子TGF-β1和IL-6的mRNA表达水平显著升高,1α,25(OH)2D3(10 nM、100 nM)处理显著抑制了 HK-2细胞由高糖引起的TGF-β1和IL-6表达的升高。结论:高糖刺激引起肾小管上皮细胞脂质蓄积及炎症反应。250HD与1α,25(OH)2D3均能抑制由高糖所致的脂质蓄积,其中1α,25(OH)2D3通过调控SCAP-SREBPs通路实现对高糖所致脂质蓄积的抑制作用。1α,25(OH)2D3能改善肾小管上皮细胞内由高糖所致的炎症反应。以上结果提示我们维生素D对密切接触有毒有害物质的糖尿病患者可能具有保护作用。