目的：　　本课题通过建立大鼠肝缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）模型和大鼠肝线粒体缺氧复氧（Anoxia/reoxygenation,A/R）损伤模型，研究肝I/R损伤的相关线粒体机制，提出线粒体保护的重要性。同时，首次研究积雪草酸（Asiatic acid, AA）对大鼠肝I/R损伤的保护作用及相关线粒体机制。在离体线粒体水平和细胞水平探讨AA对线粒体功能的直接影响，从线粒体水平深入阐明其肝保护作用机制。利用药物亲和反应性的靶点稳定性（drug affinity responsive target stability,DARTS）技术确定AA在小鼠肝脏线粒体上的直接作用靶点，进一步阐明其活性的机制。　　方法：　　健康雄性SD大鼠30只，质量230-250g，随机分为5组(n=6)，包括假手术组(SHAM组)、肝I/R组和不同剂量AA组。SHAM组仅暴露肝门，不夹闭血管。IR组采用夹闭左、中叶肝蒂、门静脉和肝动脉支1 h，然后松开血管夹恢复血流6 h的方法制备大鼠肝I/R模型。AA组于肝缺血前12 h和1 h分别灌胃给药两次。各实验组于再灌注6 h抽取下腔静脉血样并取肝组织。采用试剂盒测定血清中谷草转氨酶(AST)活性和TNF-α含量；通过HE染色，光镜下观察肝组织病理学变化；采用试剂盒检测肝组织中ATP和MDA水平以及SOD、过氧化氢酶活性。再灌注6 h后，采用差速离心法分离各组肝线粒体，Clark氧电极法检测线粒体呼吸功能；采用试剂盒检测线粒体中ATP和MDA水平；利用罗丹明123（Rhodamine123,Rh123）荧光探针检测线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）。差速离心法分离健康大鼠肝线粒体，采用Amplex red/辣根过氧化物酶法检测AA对不同底物条件下线粒体ROS生成的影响。利用Clark氧电极建立线粒体A/R损伤模型，通过线粒体在密闭体系中的呼吸耗氧诱导缺氧，缺氧5 min后，加入新鲜呼吸介质实现复氧，然后加入ADP后测定线粒体呼吸参数。通过Amplex red/辣根过氧化物酶法检测线粒体A/R生成的ROS。　　分别采用密度梯度离心和差速离心法分离小鼠脑和肝线粒体。利用Clark氧电极研究线粒体呼吸和细胞呼吸耗氧速率。分别采用DCFH-DA荧光探针和Amplex red/辣根过氧化物酶法检测小鼠脑和肝线粒体呼吸过程中ROS的产生。利用Rh123和JC-1荧光探针分别检测离体线粒体和HepG2细胞的MMP。肝线粒体钙的释放以Calcium Green5N作为探针，通过荧光分光光度计动态监测。ATP的含量使用ATP检测试剂盒测定。钙离子诱导的线粒体肿胀和线粒体在低渗性醋酸钾中的肿胀通过紫外分光光度计检测540 nm吸光度的变化来分析。利用台盼蓝染色法测定细胞存活率。细胞凋亡和坏死利用Annexin V/PI双染染色试剂盒通过流式细胞仪来评估。肝细胞线粒体和HepG2细胞细胞色素c的释放通过Western blot法检测。HepG2细胞的葡萄糖消耗量采用葡萄糖检测试剂盒（葡萄糖氧化酶法）测定。　　利用差速离心法分离小鼠肝线粒体。线粒体经M-PER裂解后，和不同浓度的AA在30℃条件下孵育，然后制备DARTS样品。样品进行SDS-PAGE分离后利用银染进行分析。差异条带切胶回收，用蛋白质谱分析目的条带，质谱测试原始文件用BioworksBrowser3.3软件通过蛋白数据库比对确定目标蛋白。用Western blot验证靶点蛋白。原代培养小鼠肝细胞，利用不同浓度的AA处理3小时，MTT法检测细胞活力，通过试剂盒测定肝细胞的氨消耗和尿素生成量。　　结果：　　大鼠肝I/R诱导了明显的肝损伤，包括血清中AST和TNF-α的释放增加，肝组织细胞坏死，标志组织氧化损伤的MDA水平上升，SOD和过氧化氢酶的活性下降。50 mg/kg剂量AA处理可显著减轻大鼠肝I/R引起的肝损伤，抑制AST和TNF-α的释放，肝细胞坏死明显减轻。另外，AA还能明显抑制肝I/R诱导的MDA的生成，显著提高肝组织SOD和过氧化氢酶的活性，表明AA能通过减轻氧化应激而改善I/R诱导的肝损伤。在对分离的各组大鼠肝线粒体的研究中发现，肝I/R诱导了明显的线粒体损伤，表现为呼吸功能严重受损，MMP下降，ATP合成障碍。I/R组大鼠肝线粒体三态呼吸速率下降，四态呼吸速率上升，RCR（Respiratory control ratio,RCR）和ADP/O值均明显降低。另外，I/R组大鼠肝线粒体发生明显的氧化损伤，表现为线粒体的MDA水平上升。50 mg/kg剂量AA能明显对抗肝I/R诱导的肝线粒体损伤，保护MMP，改善呼吸作用，促进ATP合成。另外，AA给药显著降低了肝线粒体的MDA水平，提示AA的保护作用和减轻I/R诱导的线粒体氧化损伤有关。在对正常大鼠肝线粒体呼吸作用的研究中发现，无论添加鱼藤酮与否，AA都能剂量依赖性的抑制以琥珀酸盐为底物的线粒体呼吸产生的ROS。特别是当体系中不含鱼藤酮时，ROS的生成明显增加，但AA的抑制活性也显著增强。这说明AA能够有效的抑制由于RET在线粒体复合物I上产生的大量ROS。另外，本研究成功制备了离体大鼠肝线粒体A/R损伤模型，发现线粒体A/R会导致线粒体功能受损，表现为三态呼吸速率下降，四态呼吸速率上升，RCR和ADP/O值均明显降低。此外，我们还发现，当用谷氨酸盐和苹果酸盐作为底物时相比琥珀酸盐（添加鱼藤酮），线粒体的损伤更加严重，ROS生成也明显增加，这可能和体系中存在复合物Ⅱ到复合物Ⅰ的RET有关。AA对谷氨酸盐和苹果酸盐作为底物时离体肝线粒体A/R损伤的保护作用更为明显，表现为提高三态呼吸速率，降低四态呼吸速率，RCR和ADP/O值均明显上升。　　分离的小鼠脑线粒体经过AA处理后，以琥珀酸盐为底物的线粒体四态呼吸速率明显提高，RCR值降低。AA还能诱导脑线粒体MMP的下降，有一定的剂量依赖性。此外，钙离子诱导的脑线粒体肿胀也能被AA所抑制。AA处理离体小鼠肝线粒体，能够显著刺激以琥珀酸盐为底物的四态呼吸速率，导致RCR值下降，降低MMP和ATP水平，诱导线粒体钙离子的释放。高浓度的AA能够使线粒体中ATP的含量明显下降，并促进细胞色素c的释放。此外，AA对小鼠脑和肝线粒体线粒体呼吸产生的ROS也有显著的抑制作用。上述结果表明，AA能直接作用于线粒体，并且是一种线粒体解偶联剂。本研究还发现AA虽然能抑制钙离子诱导的线粒体肿胀，但是和经典的质子型解偶联FCCP相比，AA不能诱导线粒体在低渗性醋酸钾中的肿胀。质子型解偶联剂的抑制剂6Kch也对AA诱导的解偶联作用没有明显影响。另外，AA诱导的MMP的下降和钙离子的释放是个缓慢的过程，这和强解偶联剂FCCP诱导的瞬时的强烈反应明显不同，表明AA是一种温和的非质子型解偶联剂。高剂量的AA可诱导HepG2细胞MMP的快速下降、ATP的耗竭和细胞色素c从线粒体释放到胞浆中，从而诱导细胞快速死亡；低剂量的AA能够促进HepG2细胞的呼吸耗氧和葡萄糖摄取，提示AA在细胞水平的解偶联作用。通过二磷酸鸟苷（Guanosine diphosphate,GDP）抑制解偶联蛋白（Uncoupling protein,UCP）或通过苍术苷（Carboxyatractyloside,Catr）抑制腺嘌呤核苷酸转运体（Adenine nucleotide transporter,ANT）可减弱AA对线粒体呼吸、MMP、线粒体钙离子释放和HepG2细胞死亡的影响。当两种抑制剂联合使用，AA介导的解偶联作用明显减轻。　　小鼠肝线粒体温和裂解物和AA在30℃条件下共孵育后，制备了DARTS样品。样品经SDS-PAGE分离后银染，结果显示，在130 kD和170 kD之间有一蛋白条带明显受到了AA的保护，显示出对Pronase酶水解抗性。用蛋白质谱对目标条带进行了分析，结果发现，氨甲酰磷酸合成酶1（Carbamyl phosphate synthetase,CPS1）可能是AA的直接作用靶点。通过Western blot证实CPS1是AA作用于小鼠肝线粒体的直接靶点。当原代培养的小鼠肝细胞用不同浓度的AA处理后发现，AA能够使肝细胞的氨解毒能力下降，尿素的产生减少，表明AA可以和CPS1结合，抑制其活性，从而抑制肝细胞的尿素循环。　　结论：　　肝I/R能够诱导肝线粒体严重的氧化应激损伤，线粒体功能发生明显障碍。AA可以通过保护线粒体功能对抗肝组织损伤。另外，AA可以直接作用于线粒体，是一种新型的线粒体解偶联剂。AA能通过抑制RET诱导的ROS产生，减轻肝I/R诱导的氧化应激损伤，有效保护线粒体功能。AA的解偶联活性和UCP和ANT的激活有关。高浓度的AA能够完全解偶联线粒体，诱导HepG2细胞的死亡。另外，AA属于温和的解偶联剂，能够在低浓度条件下对线粒体产生适度的解偶联作用。CPS1可能是AA作用于小鼠肝线粒体的直接靶点。高浓度的AA能够通过抑制CPS1的活性影响鸟氨酸循环，损害肝细胞的氨解毒功能。