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灰树花是近年来研究比较多的珍奇药食用菌之一,其多糖和多糖复合物在抗肿瘤、抗病毒、增强免疫、降血糖、治疗糖尿病等多方面具有明显的生物活性。本文在实验室前期研究工作的基础上,以一株适宜在米糠、麸皮提取物上生长、高产多糖的灰树花诱变菌株Grifola sp.CGMCC4179为主,与原始菌株Grifolafrondosa ACCC50246进行对比研究,优化了发酵培养基组成,建立了生长动力学模型,研究诱变菌种的生长优势,并通过两种菌株生产的灰树花多糖体外抗氧化活性的比较,明确其生物活性,为走向工业化生产提供依据。
本研究包括的主要内容如下:
(1)通过对米糠麸皮酶解均匀试验探索,综合考虑确定米糠麸皮酶解条件为pH4.4,温度40℃,酶添加量2.5％,液料比25:1,酶解时间16h,用植物复合水解酶Viscozyme L处理米糠、麸皮得到还原糖含量分别为:35.854 mg／g、45.246mg／g。同时通过SPSS分析得到米糠麸皮酶解的回归方程为:
Y1=-7.283+0.348x2+0.762x3x5
Y2=38.119—1.012 x21+0.734x3x5式中:Y1(mg／g)米糠酶解得到的还原糖量；Y2(mg／g)麸皮酶解得到的还原糖量；x1 pH值；x2(℃)温度；x3(％)酶添加量；x4液料比；x5(h)酶解时间。
(2)研究了灰树花原始菌株Grifola frondosa ACCC50246和诱变菌株Grifolasp.CGMCC4179以米糠麸皮酶解物为主的培养基的最佳组成。以灰树花菌丝干重和胞内多糖含量作为考察指标,对米糠(1～12％)、麸皮(1～12％)、磷酸二氢钾(0.02～0.35％)和硫酸镁(0.01～0.23％)添加量进行U12*(124)均匀试验,经直观分析和SPSS线性回归分析,得到原始菌种最大菌丝干重发酵培养基组成为:米糠12 g／100mL,麸皮12 g／100mL,磷酸二氢钾0.02 g／100mL,硫酸镁0.23 g／100mL,最大菌丝干重为1.61 g／100mL。最佳产胞内多糖的发酵培养基组成为:米糠12g／100mL,麸皮12 g／100mL,磷酸二氢钾0.02 g／100mL,硫酸镁0.01 g／100mL,得到最大胞内多糖为0.186 g／100mL。变异菌种最大菌丝干重发酵培养基组成为:米糠12 g／100mL,麸皮12 g／100mL,磷酸二氢钾0.02 g／100mL,硫酸镁0.01 g／100mL,最大菌丝干重为1.67g／100mL。最佳产胞内多糖的发酵培养基组成为:米糠12g／100mL,麸皮12 g／100mL,磷酸二氢钾0.35 g／100mL,硫酸镁为0.01 g／100mL,得到最大胞内多糖为0.193 g／100mL。变异菌种的菌丝干重和胞内多糖产量分别比原始菌种增长了3.7％,3.8％。利用SPSS软件对均匀试验结果进行回归模型分析。得出两种菌株菌丝干重Y3(g／100mL)和Y5(g／100mL)、胞内多糖Y4(g／100mL)和Y6(g／100mL)与自变量米糠x1(g／100mL)、麸皮x2(g／100mL)、KH2PO4 x3(g／100mL)、MgSO4x4(g／100mL)的回归方程分别为:
(3)利用数学回归分析的方法建立了灰树花原始菌株和变异菌株摇床发酵动力学模型分别为:式中X1为米糠量(g／100mL),x2为麸皮量(g／100mL),Cx(t)为菌丝量(g／100mL)。
(4)通过以上摇床发酵动力学模型方程,在理论基础上进一步验证了变异菌种Grifola sp.CGMCC4179在米糠、麸皮培养基上能得到高于原始菌种Grifolafrondosa ACCC50246的菌丝产量。
(5)在米糠麸皮为主的培养基上发酵灰树花变异菌株和原始菌株,从发酵液和菌丝体中分别得到两种胞外多糖和两种胞内多糖,化学性质验证均为非淀粉类多糖,不含氨基酸和游离蛋白质。对这四种灰树花多糖,在4000～400cm-1区间进行红外光谱扫描分析,均具有一般多糖类物质的特征吸收峰。
(6)通过3种不同体系(羟自由基、还原能力、DPPH·)研究了米糠麸皮发酵灰树花生产的多糖的体外抗氧化活性,结果表明试样都具有一定的抗氧化活性,而且随着浓度的增加其抗氧化能力也相应增加。其中变异菌种发酵得到的灰树花多糖的抗氧化能力不但基本能达到原始菌种的能力,而且在清除DPPH·的能力中表现出更强的生物活性,说明变异菌种不但多糖产量提高了,而且其生物活性也有所提高。