论文部分内容阅读
目的:乳腺癌是发病率最高的女性恶性肿瘤,目前已逐渐演变为一个威胁全球公共健康安全的重要问题。最新评估数据表明,2020年全球乳腺癌新发病例数已达226万。乳腺癌作为一种异质性疾病,预后情况差异较大。约有65-75%的晚期乳腺癌患者会发生骨转移,转移部位多见于胸椎、腰椎、肋骨以及髋关节。骨组织作为一个复杂的生态环境,由成骨细胞、破骨细胞以及多种细胞因子组成,乳腺癌细胞对骨组织的侵犯会导致一系列骨相关事件的发生,严重影响患者的生活质量。目前,治疗乳腺癌骨转移的主要措施包括放疗、手术以及骨改良药物联合治疗等,但仍缺乏有效的治愈手段。因此,研究有效的靶点来预防和治疗乳腺癌骨转移对于提高患者生存质量和预后至关重要。跨膜通道样蛋白（TMC）家族基因的异常表达已在多种癌症中被证实。离子通道蛋白的异常表达可参与多种肿瘤发展进程,如异常增殖、血管新生以及组织侵袭和转移等。TMC5是一种介导离子运输的多次跨膜蛋白。目前,TMC5在乳腺癌中的表达情况及其与乳腺癌进展的关系尚未确定。本研究检测乳腺癌组织样本中TMC5的表达情况,进行一系列体内外功能实验探究了TMC5对乳腺癌发生发展,尤其是对乳腺癌骨转移能力的影响及其作用机制,从而为乳腺癌骨转移的治疗提供新的治疗方向和治疗靶点。研究方法:1、通过Real-time PCR验证TMC5在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达,并分析其与临床病理资料的相关性。2、构建慢病毒稳转细胞系,体内实验验证TMC5对小鼠乳腺癌转移情况的影响,并利用X线成像、小鼠大体解剖、组织H&E染色、骨组织TRAP染色技术检测小鼠乳腺癌的远处器官转移情况。体外实验验证TMC5对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响。3、模拟骨微环境,探究TMC5对乳腺癌细胞骨转移趋化性、骨微环境定殖能力的影响,并通过TRAP实验明确了TMC5对破骨细胞激活的作用。Western blotting检测TMC5对乳腺癌细胞组织蛋白酶L（Cat L）表达水平的影响。4、使用特异性钙离子探针Fluo-4研究TMC5对调节乳腺癌细胞钙离子内流的作用,并通过使用钙离子螯合剂探究Ca2+信号对TMC5生物学功能的影响。5、利用Western blotting实验探究ERK1/2的磷酸化对TMC5生物学功能的介导作用。结果:1、与癌旁组织相比,TMC5在乳腺癌组织中的表达量显著上调。结合临床病理资料分析发现TMC5在乳腺癌组织中的高表达与高组织学分级（p=0.028）、淋巴结转移（p=0.045）和骨转移（p=0.022）显著相关。2、体内实验证明,过表达TMC5显著促进乳腺癌细胞骨转移的发生,而对肺肝转移无显著影响。3、体外实验表明,过表达TMC5显著提高乳腺癌细胞的转移潜能,而敲减TMC5显著降低乳腺癌细胞的转移潜能。Western blotting结果显示,过表达TMC5促进Snail和Vimentin的表达,抑制E-cadherin的表达。4、在MC3T3E1细胞提供的骨微环境中,过表达TMC5促进乳腺癌细胞向骨转移微环境的趋向性迁移,敲减TMC5抑制乳腺癌细胞向骨转移微环境的趋向性迁移。软琼脂集落形成实验显示,过表达TMC5增加乳腺癌细胞在骨微环境中的增殖,敲除TMC5抑制乳腺癌细胞在骨微环境中的增殖;TRAP实验结果显示,过表达TMC5促进破骨细胞分化,敲除TMC5抑制破骨细胞分化。Western blotting结果显示过表达TMC5显著促进组织蛋白酶Cat L表达,敲减TMC5显著抑制Cat L表达。Transwell结果显示,Z-FYCHO作为Cat L特异性抑制剂,可以显著逆转过表达TMC5引起的乳腺癌细胞迁移和侵袭增加,同时也可以显著抑制过表达TMC5导致的成熟破骨细胞数量增加。5、共聚焦结果显示,过表达TMC5可增强Ca2+的内流强度,而敲除TMC5降低Ca2+的内流强度。Transwell结果显示细胞内钙离子阻遏剂BAPTM/AM的使用消除了TMC5在细胞迁移、侵袭中的促进作用,Western blotting和免疫荧光结果显示BAPTM/AM消除了过表达TMC5所诱导的Snail核易位和EMT相关基因的表达改变,Western blotting结果显示BAPTM/AM抵消了过表达TMC5对Cat L表达以及对破骨细胞活化的促进作用。6、Western blotting结果显示过表达TMC5可显著促进乳腺癌细胞中ERK1/2的磷酸化。Transwell结果显示过表达TMC5所引起的乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的增加可被敲减Snail逆转,而敲减TMC5所引起的乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的减少可被过表达Snail逆转,同时ERK通路抑制剂U0126可消除过表达TMC5对乳腺癌细胞迁移、侵袭的促进作用。结论:1、与癌旁非癌组织相比,TMC5在乳腺癌组织中的表达量显著上调。2、过表达TMC5后显著促进乳腺癌细胞MDA-MB-231和T47D的迁移、侵袭以及向骨微环境的趋向性迁移以及在骨微环境中的定植能力。3、TMC5通过增强乳腺癌细胞的Ca2+内流,激活Ca2+-ERK1/2-Snail信号通路促进乳腺癌骨转移。