脓毒症损伤涉及炎症、免疫等病理生理过程。脓毒症状态下重要器官（肺、心脏、肝脏以及肾脏）发生炎症改变，充血水肿，造成急性器官功能受损。脓毒症时T淋巴细胞免疫功能持续处于抑制状态，有研究表明脓毒症时IL-2的水平一直处于较低水平，IL-2作为T淋巴细胞的重要生长因子，其产生减少可诱导大量T淋巴细胞凋亡，数量减少;此外，出现了倾向于辅助性T细胞(Th)2型的免疫反应，Th2分泌的抗炎细胞因子IL-4增多，而Th1分泌的IL-2和IFN-γ等促炎细胞因子减少，明显损害了机体的细胞免疫功能。　　α7型烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)是胆碱能抗炎通路发挥抗炎效应的关键受体，α7nAChR是目前研究最多的胆碱能受体，其广泛表达于中枢和周围神经系统。越来越多的研究证明，α7nAChR不仅表达于神经元细胞，而且还表达于一些免疫细胞，例如巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)、T和B淋巴细胞、内皮细胞、脂肪细胞以及肠和肺上皮细胞。体内外实验研究证实，激动α7nAChR可以控制许多抗炎细胞因子的表达，减轻脓毒症动物模型的临床表现（包括嗜睡、腹泻）和防止内毒素(LPS)诱导的体温过低和血细胞比容减少，提高脓毒症动物的存活率。而抑制α7nAChR则导致脓毒症向更严重的方向发展。但上述结论主要基于体外实验或从外周干预的体内动物实验而得出，关于中枢途径干预对脓毒症动物模型的预后及T淋巴细胞免疫调节功能的潜在影响尚不清楚。　　本实验观察中枢途径干预对脓毒症动物生存率的影响，并采用CCK法检测不同处理方法后CD4+T细胞增殖活性改变，应用ELISA及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等技术从蛋白和基因水平检测细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的表达，以充分了解T细胞免疫功能的变化及其意义。　　研究目的:　　1.观察中枢干预α7nAChR对严重脓毒症大鼠生存率、脾脏T淋巴细胞功能的影响;　　2.观察电刺激或离断迷走神经对严重脓毒症大鼠脾脏T淋巴细胞功能变化的影响;　　3.观察中枢干预HMGB1对严重脓毒症大鼠生存率及脾脏T淋巴细胞功能的影响。　　研究方法:　　1.采用免疫磁珠法分离正常SD大鼠脾脏CD4+T细胞，流式细胞术鉴定CD4+T细胞纯度。　　2.采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症大鼠模型。(1)设药物干预组、模型组、假伤组，药物干预组与模型组均采用CLP法制备脓毒症大鼠模型，药物干预组予PNU-282987（0.16μg/μl，5μl）和MLA（2.4 ng/μl，5μl），而模型组和假伤组予相同体积的生理盐水，分别于术后0h、6h进行侧脑室注射。分别于术后12h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h及168 h计数各小组存活大鼠数目，采用Kaplan-Merer法进行生存率分析。(2)雄性SD大鼠随机分为假手术（SHAM）组、CLP+NS组、CLP+α7nAchR激动剂(PNU)0.25μg组、CLP+PNU0.8μg组和CLP+PNU2.56μg组。行CLP后分别通过中枢注入5μl生理盐水(NS)和5μl PNU-282987（0.05μg/μl、0.16μg/μl和0.512μg/μlPNU-282987），所有动物于造模成功后24 h脱劲处死，提取脾脏CD4+T细胞。(3)雄性SD大鼠被随机分为SHAM组、CLP+NS组、CLP+α7nAchR抑制剂(MLA)6 ng组、CLP+MLA12 ng组和CLP+MLA24 ng组，所有动物于造模成功后24 h脱劲处死，提取脾脏T细胞。(4)雄性SD大鼠被随机分为SHAM组、CLP+NS组、CLP+PNU0.8μg组和CLP+MLA12 ng组，所有动物于造模成功后分别于24 h、48 h、72 h脱劲处死，提取脾脏CD4+T细胞。(5)雄性SD大鼠被随机分为SHAM、CLP+NS组、CLP+A-Box（HMGB1拮抗剂）1μg组和CLP+A-Box10μg组，所有动物于造模成功24 h之后脱劲处死，提取脾脏CD4+T细胞。(6)雄性SD大鼠被随机分为SHAM组、CLP+迷走神经电刺激组(VNS)和CLP+迷走神经离断组(VGX)，所有动物于造模成功后分别于24 h、48 h、72 h脱劲处死;提取脾脏CD4+T细胞。　　3.纯化的CD4+T细胞用含刀豆素A的培养基调整细胞浓度为1106/ml(5排重复孔，每排末设调零孔)，加入96孔板中，每孔200μl。每孔刀豆素A的浓度为5μg/μl。96孔板其余各孑孔中分别加入消毒的PBS200μl（保湿），置细胞培养箱68 h。每孔各收集100μl上清装入EP管中(ELISA检测细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ)。再加入CCK-8每孔10μl，轻轻震荡后置细胞培养箱2h后，采用酶标仪450 nm测吸光度(OD)值。此外，采用Trizol法提取CD4+T细胞总RNA，进行RT-PCR分析，β-actin作为内参照。从基因水平检测IL-2、IL-4和IFN-γ表达水平。　　4.统计学方法:采用SPSS19.0统计软件对数据进行分析，计量资料用(x)±s表示，单因素多组数据进行方差分析(One-Way ANOVA)，俩样本间比较采用t检验。生存率使用Kaplan-Merer法做统计分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。　　研究结果:　　1.正常大鼠脾脏单个核细胞经过MACS两次分选后，通过流式细胞仪检测获得CD4+T细胞纯度可达90％。CD4+T细胞经过台盼蓝染后检测，其活性大干98％。　　2.侧脑室注射PNU和MLA对脓毒症大鼠存活率及脾脏T淋巴细胞功能的影响:①假伤组动物存活率为100％。与假伤组比较，CLP组存活率显著降低(P＜0.05)，PNU处理组存活率较CLP组升高(P＜0.05)，而MLA处理组存活率与CLP组相比无显著意义(P＞0.05);②CLP术后T淋巴细胞增殖能力显著下降(P＜0.01)，IL-2、FN-γ表达水平降低,IL-4表达增强(P＜0.05)。而PNU处理组T淋巴细胞增殖活性升高(P＜0.01)，IL-2、IFN-γ水平增高，IL-4表达则明显降低(P＜0.05);且PNU0.8μg组T淋巴细胞增殖能力较PNU0.25μg组和PNU2.56μg组更为显著（P＜0.01）。侧脑室注射MLA后T淋巴细胞增殖能力均降低(P＜0.01)，IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4表达增强(P＜0.05)，不同剂量之间无显著性差异(P＞0.05)。③PNU、MLA处理后分别于24 h、48 h、72 h观察T淋巴细胞免疫功能，PNU组24 h、48 h、72 h较CLP组T淋巴细胞增殖能力均升高，IL-2、IFN-γ水平上升，IL-4水平下降(P＜0.05);而MLA处理组24 h、48 h、72 h较CLP组T淋巴细胞增殖能力均明显下降，IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4表达则显著增强(P＜0.05)。　　3.切断和电刺激迷走神经对严重脓毒症大鼠脾脏T淋巴细胞功能的影响:与假伤组比较，CLP组T淋巴细胞增殖能力水平显著下降(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ水平降低，而IL-4水平升高(P＜0.05)。与CLP组比较，VGX组T淋巴细胞增殖能力显著下降(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4水平增加(P＜0.05);而VNS组T淋巴细胞增殖能力显著增强(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ分泌量显著增多，IL-4分泌量显著减少(P＜0.05)。　　4.侧脑室注射HMGB1拮抗剂(A-Box)对脓毒症大鼠的存活率及脾脏T淋巴细胞功能的影响:①假伤组动物存活率为100％。与假伤组比较，CLP组存活率显著降低(P＜0.05)，A-Box1μg处理组存活率与CLP组相比无显著差异(P＞0.05)，而A-Box10μg处理组存活率较CLP组显著升高(P＜0.05);②CLP术后T淋巴细胞增殖能力显著下降(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ表达水平降低，IL-4水平升高(P＜0.05)。A-Box处理组T淋巴细胞增殖活性显著升高(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ水平升高，IL-4水平则降低(P＜0.05)，其中以高剂量组影响尤为显著。　　研究结论:　　1.中枢给予α7烟碱乙酰胆碱受体激动剂可有效提高脓毒症大鼠的生存率，并显著改善脾脏T淋巴细胞的免疫功能;而中枢阻断α7烟碱乙酰胆碱受体对严重脓毒症大鼠的存活率无显著影响，并抑制T淋巴细胞的免疫能力。　　2.电刺激迷走神经能促进严重脓毒症大鼠脾脏T淋巴细胞的免疫功能增强，离断迷走神经后T淋巴细胞的免疫功能则明显下降。　　3.中枢给予大剂量高迁移率蛋白B1拮抗剂(A-Box)可明显改善脓毒症大鼠预后，并提高脾脏T淋巴细胞的免疫功能。