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背景卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指女性40岁前以闭经、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高为特征的一种疾病[1]。化疗是目前治疗恶性肿瘤的有效手段,但化疗药会对患者卵巢造成不同程度的损伤,甚至有部分患者发展成为POF[2]。环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX),是化疗常用的烷化剂,研究CTX造成的POF治疗方案具有十分重要的意义。目前治疗POF的方案均不能从根本上起到修复卵巢的作用,近些年间充质干细胞治疗POF成为研究热点,人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUMSCs)来至废弃的脐带,资源丰富获取便捷,属于免疫缺陷细胞,具有多向分化潜能成为干细胞治疗POF的重点研究对象[3]。我们将hUMSCs从脐带中分离出来,期望探究出一种可修复卵巢,从根本上解决POF的治疗方案。目的(1)采用组织贴壁法分离hUMSCs,对其进行鉴定并观察其生物学特性。(2)观察hUMSCs成脂、成骨、成软骨分化能力。(3)评价CTX造POF动物模型方案是否成功。(4)探究hUMSCs对POF大鼠的治疗作用。(5)初步探究hUMSCs修复卵巢功能的可能机制。方法采用组织贴壁法将hUMSCs从脐带中分离出来并进行培养,显微镜下观察细胞形态;流式细胞仪鉴定细胞表面抗原;分别加入成脂肪、成骨、成软骨诱导分化液诱导其向成脂、成骨、成软骨方向进行分化,观察其多向分化潜能。使用环磷酰胺经腹腔注入SD大鼠造POF模型,第1d注入浓度为10mg/ml的CTX,第2~15d连续注射浓度为3.2mg/ml的CTX,按照5m L/kg体重的量注射,每天1次。观察记录大鼠一般情况。血清检测建模前后1d卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)、雌二醇(Estradiol,E2)含量,结合HE染色观察建模前后卵巢组织形态以及卵泡情况判断建立的POF模型是否成功。给每只治疗组大鼠尾静脉注射1×106/ml hUMSCs,采用荧光标记的原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测hUMSCs在卵巢内的分布和分化情况。hUMSCs移植后1d、17d检测血清中卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)、血清抑制素B(Serum inhibin B,INHB)、抗苗勒管激素(Anti Mullerian hormone,AMH)含量评价hUMSCs对卵巢储备功能改善情况。综合免疫组化检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteine aspartic acid protease 3,Caspase-3)信号表达情况;hUMSCs移植后HE染色观察到的卵巢组织形态学变化、卵泡数情况;透射电镜观察到的卵巢超微结构变化情况;FISH检测到hUMSCs在卵巢内的分化情况,推测hUMSCs修复POF的可能机制。让大鼠进行交配,孕14d解剖观察活胎数和吸收胎数比较hUMSCs对大鼠生育能力改善情况。结果(1)从脐带中分离得到的细胞在镜下观察成纤维细胞样形态,大部分呈梭形。流式细胞仪检测其高表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR,结合表面抗原和细胞形态,证明获取的细胞为hUMSCs。(2)油红O染色后观察细胞由长梭形变为椭圆形或者圆形且细胞内有被染成红色的光亮脂滴,提示成功诱导分化出了脂肪细胞;茜素红染色后观察到细胞由长梭形转变为多角形且内有沉积的钙盐,提示成功诱导分化出了成骨细胞;阿尔新蓝染色后观察到细胞染色呈强阳性,而未加入诱导分化液的细胞呈松散状,细胞形态依旧呈长梭形,提示成功诱导分化出了成软骨细胞。证明了hUMSCs具有多向分化潜能。(3)与阴性对照组相比,模型组大鼠血清中E2含量下降,FSH含量增高;HE染色切片观察到模型组大鼠生长卵泡数均减少、闭锁卵泡数增加,符合临床上POF的典型特征,说明成功建立POF模型。(4)血清检测得到hUMSCs移植组INHB、AMH的量在hUMSCs移植后17d均比模型对照组高。HE染色观察到hUMSCs移植组在1d、17d两个时间点的生长卵泡数均高于模型对照组,闭锁卵泡数降低,证明hUMSCs可改善卵巢储备功能,对卵巢有修复作用。(5)FISH检测结果显示,hUMSCs在卵巢组织间隙分布,且有少量分化成了卵巢颗粒细胞和卵子细胞。电镜观察到hUMSCs移植组卵巢颗粒细胞逐渐被修复。免疫组化检测未在hUMSCs移植组生长卵泡中检测到Caspase-3阳性信号,且Caspase-3的信号表达低于模型对照组。推测hUMSCs可能是通过修复卵巢颗粒细胞抑制生长卵泡凋亡,分化为卵子细胞以及颗粒细胞来对卵巢进行修复。(6)hUMSCs移植组得到的活胎数有上升趋势,但与模型对照组无显著性差异。结论(1)组织贴壁法可成功将hUMSCs分离出来并进行传代培养,hUMSCs呈长梭形,表达与间充质干细胞相似的表面抗原,具有多向分化潜能。(2)此次CTX造模方案成功建立了大鼠POF模型,hUMSCs可改善POF鼠卵巢储备功能,对卵巢起修复作用。(3)hUMSCs可能是通过修复卵巢颗粒细胞,抑制生长卵泡凋亡,部分分化为卵子细胞、颗粒细胞来对卵巢进行修复。(4)hUMSCs对POF大鼠生育状况有改善作用。