蛋白质磷酸化是指在蛋白激酶的作用下,在蛋白质氨基酸残基上加上磷酸基团的过程。这一过程是可逆的,磷酸化蛋白可以在蛋白磷酸酶的作用下,发生去磷酸化。蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程与细胞信号传导过程密切相关,而且还调节着细胞的增殖,分化,翻译等一系列生理变化。特别是邻近氨基酸的同时磷酸化现象更会极大地影响蛋白质的生物活性。目前,质谱及其相关技术由于具有较高的灵敏度及准确性,已经成为磷酸化蛋白质组分析的重要技术手段。然而,磷酸化多肽的低含量及低的离子化效率导致其在进行质谱分析时信号受到非磷酸化多肽的严重抑制。另外,多磷酸化多肽相比于单磷酸化多肽具有更低的离子化效率；而内源性磷酸化多肽在分析时还将受到蛋白质、脂类等的干扰。因此,在质谱分析前对目标磷酸化多肽进行特异性的分离和富集是对其进行有效分析的必要前提。本文利用一些新技术及新原理开发了五种磷酸化多肽的预富集方法,主要内容如下：1.评述了磷酸化蛋白质组学的研究现状,着重介绍了磷酸化多肽的预富集方法以及一些新技术在这些方法中的应用进展。2.采用简单的合成策略,制备了一种新的固定金属亲和材料——砷酸锆键合磁性硅胶纳米颗粒,并将其应用于磷酸化多肽的富集。这种材料具有纳米尺寸,可以提供较大的比表面积用于吸附目标分析物；同时由于尺寸小、表面活性位点高,使其具有很好的分散性及较高的萃取效率。Fe304的存在使材料具有磁分离能力,使整个萃取操作过程简便快速。这种材料不仅对简单蛋白质酶解物中的磷酸化多肽具有很好的萃取效果,而且在复杂的样品中也表现出良好的富集能力。3.考察了钙钛矿作为复合金属氧化物亲和材料用于磷酸化多肽的选择性萃取。通过对比发现,钙钛矿(包括MgTiO3, CaTiO3, SrTiO3, BaTiO3和CaZrO3)比Zr02和Ti02对磷酸化多肽具有更好的萃取效果；并且不同的钙钛矿的选择性也存在差异,其中CaTiO3和SrTiO3对复杂样品中的磷酸化多肽具有很好的选择性,而CaTiO3的选择性最好。文中讨论了这些材料的选择性差异可能来源于不同物质间的晶体结构的差异,以及材料中不同元素接受孤对电子能力的差异。最后,我们将CaTiO3和TiO2用于Jurkat-T细胞裂解物酶解产物中的磷酸化多肽的富集,其中CaTiO3表现出很好的选择性及特异性。4.基于膦酸盐修饰的金属氧化物提出了一种新的磷酸化多肽及多磷酸化多肽的富集方法。含有不同磷酸根个数的磷酸盐修饰的ZrO2及TiO2对磷酸化多肽体现出不同的选择性及萃取效率。相比于未修饰的ZrO2和TiO2,经磷酸修饰的ZrO2和TiO2对磷酸化多肽具有更高的选择性及萃取效率；而经阿仑膦酸钠(含两个磷酸根)修饰的ZrO2和TiO2对多磷酸化多肽具有更高的选择性及萃取效率。最后文中根据对比结果讨论了膦酸盐修饰的金属氧化物对磷酸化多肽的萃取机理,并将材料用于细胞酶解产物中磷酸化多肽的富集。5.制备了钛键合的磁性介孔二氧化硅微球,并将其用于内源性磷酸化多肽的特异性富集。将钛键合在介孔二氧化硅(mSiO2)的表面,形成一层SiO2和TiO2的复合物涂层。这一过程并不改变mSiO2孔径大小,保留了其高度有序的孔道结构。利用mSiO2对蛋白质的尺寸排阻作用以及TiO2对磷酸化多肽的亲和作用,这种材料可以有效地用于生物样品中内源性磷酸化多肽的分离富集。另外,介孔材料具有较大的比表面积可以提供更多的吸附位点；同时材料的磁性能使得整个材料合成及萃取操作过程更加简单快速。6.采用溶胶-凝胶法制备了含钛的磁性介孔硅球,并将其用于同一样品中内源性多肽及内源性磷酸化多肽的同时分析。mSiO2已被证明可以用于内源性多肽的选择性萃取,因此,利用所制备材料的尺寸排阻作用,Si-O-Si骨架的疏水作用及钛的亲和作用,我们可以有效地从同一样品中同时萃取到内源性多肽及内源性磷酸化多肽；然后通过不同的解吸条件可以将多肽及磷酸化多肽依次解吸下来。对于难以获取且含量稀少的生物样品,在同一样品中同时分析两种目标分析物不仅节约了生物样品的用量,而且降低了样品的损失及人为操作引起的误差。