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目的: 以Lewis肺癌细胞为靶向,探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)对癌细胞凋亡或增殖作用的影响,了解与其相关的细胞内信号途径。 方法: (1)细胞饥饿的诱导和细胞凋亡的检测:饥饿缓冲液HBSS刺激Lewis细胞0、4、8、12h后采用Annexin(Ⅴ)/PI流式双染及Hoechst33342染核检测其凋亡情况。此外,1μg/ml、10μg/ml外源性HMGB1蛋白作用于饥饿处理6h的Lewis细胞后同法检测其凋亡率和存活率。 (2)促/抗凋亡蛋白的检测:10μg/ml外源性HMGB1蛋白作用于Lewis细胞0、12、24、36、48h后,在流式分析其凋亡百分比的同时,Western blot检测促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量。 (3)RAGE和TLR-4受体检测:PCR检测Lewis细胞HMGB1相关受体的基因,荧光显微镜进一步观察HMGB1主要受体RAGE和TLR-4在Lewis细胞膜上的表达情况。此外,流式细胞术分析外源性HMGB1蛋白作用后Lewis细胞RAGE和TLR-4表达量的变化。 (4)细胞增殖情况检测:10μg/ml HMGB1蛋白作用于Lewis细胞后,应用MTT和CFSE法检测细胞增殖情况,同时检测加入RAGE和TLR-4抗体封闭细胞膜表面受体后细胞的增殖情况。Western blot进一步分析PI3K/Akt及Erk1/2蛋白的表达,并加入10μmol/L Erk1/2抑制剂U-0126后观察其对Lewis细胞增殖的影响。 结果: (1)饥饿缓冲液HBSS作用于Lewis细胞0、4、8、12h后Annexin(Ⅴ)/PI流式双染结果表明,细胞凋亡率随着时间的增加而逐渐增多;Hoechst33342染核后荧光显微镜检测的结果显示,随着时间的增加细胞体积变小,核碎裂,染色质浓缩并且凋亡的细胞数也增多。1μg/ml、10μg/ml外源性HMGB1蛋白作用于饥饿处理6h的Lewis细胞后,其凋亡率降低、存活率增加并且随着浓度的加大变化更明显。 (2)10μg/ml外源性HMGB1蛋白作用于未处理的Lewis细胞0、12、24、36、48h后其凋亡百分比降低,同时western blot结果显示随时间的增加促凋亡蛋白Bax表达量减少,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量呈上升趋势。 (3)PCR结果表明,Lewis细胞存在HMGB1相关受体RAGE、TLR-2、TLR-4和TLR-9;免疫荧光显示,HMGB1主要受体RAGE和TLR-4均表达于Lewis细胞膜上,且加入外源性HMGB1作用后RAGE和TLR-4的表达量升高。 (4)MTT和CFSE结果都表明,10μg/ml外源性HMGB1蛋白能促进Lewis细胞增殖,而RAGE和TLR-4抗体则对细胞增殖有抑制作用。Western blot结果显示,PI3K/Akt及Erk1/2蛋白活化,其磷酸化水平呈上升趋势,而Erk1/2抑制剂U-0126可抑制Lewis细胞增殖。 结论: 外源性HMGB1可通过与细胞表面RAGE/TLR-4受体的结合,介导Bax和Bcl-2信号途径而抑制饥饿诱导的细胞凋亡、促进Lewis细胞的增殖,这一细胞行为的改变依赖于PI3K/Akt和Erk1/2的信号途径。为基于HMGB1的临床肿瘤治疗的开发应用奠定了基础,并可能成为肺癌干预和治疗的一个新靶点。