论文部分内容阅读
肺癌是我国发病率和致死率最高的恶性肿瘤。按照组织类型肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC,约85%）和小细胞肺癌（SCLC,约15%）,肺腺癌是NSCLC中最常见的亚型。三分之一的肺腺癌存在KRAS突变。虽然靶向疗法和免疫检查点抑制剂的使用有效改善了晚期肺癌患者的预后水平,仍罕有靶向KRAS的药物用于临床。Cullin-4B（CUL4B）是Cullin-Ring E3泛素连接酶复合物中的支架蛋白,参与调控多种生长发育过程。研究发现,CUL4B在肿瘤中的作用具有两面性。一方面,它在许多实体瘤中高表达,对维持肿瘤的恶性行为至关重要,发挥促癌作用。另一方面,它能限制髓源抑制细胞（MDSCs）的累积和活化,在肿瘤微环境中发挥抑癌作用。为探究CUL4B在KRAS突变介导的肺腺癌发生发展中的作用,实验室前期构建了KRASG12D突变和乌拉坦（诱导KRASQ61L/R突变）诱导的小鼠肺腺癌模型。在两种模型中均观察到特异性敲除肺泡Ⅱ型上皮细胞Cul4b促进了肺腺癌生长。这是我们首次在实体瘤中发现CUL4B具有抑癌作用,然而其作用机制不明。本课题对CUL4B在KRAS突变肺腺癌中抑制肿瘤生长的机制进行了探究。第一部分CUL4B通过重塑肿瘤微环境抑制KRAS突变介导的肺腺癌进展为探究CUL4B在KRAS突变介导的肺腺癌发生发展中的作用,我们对公共数据库和KRASG12D突变介导的肺腺癌小鼠模型以及乌拉坦诱导肺腺癌小鼠模型进行了分析,并取得以下结果:1.利用公共数据库分析发现,CUL4B低表达的有吸烟史的肺腺癌患者总生存期较短;KRAS基因突变肺癌和肺腺癌患者肿瘤组织中CUL4B表达量显著低于KRAS未突变患者。提示CUL4B低表达协同KRAS突变促进肺腺癌进展。2.系统分析了特异性敲除肺泡Ⅱ型上皮细胞Cul4b对KrasG12D小鼠肺腺癌的影响,证实肿瘤细胞缺失CUL4B促进KRASG12D介导的肺腺癌进展,表现为肺部结节数增加、恶性程度加重和生存期缩短。3.对KRASG12D和乌拉坦诱导的肺腺癌小鼠模型肺组织的免疫组化和流式细胞术分析显示,敲除肺泡Ⅱ型上皮细胞Cul4b重塑肺部肿瘤微环境,导致CD4+和CD8+T细胞显著减少,而MDSCs显著增多,并且新生血管增加。但肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除Cul4b不影响无肿瘤小鼠肺发育和微环境。第二部分:缺失CUL4B引起的KRAS突变肿瘤生长加速是通过MDSCs介导的鉴于肿瘤细胞缺失CUL4B导致肿瘤微环境内MDSCs增多,为明确MDSCs在CUL4B影响KRAS突变肺肿瘤微环境调控中的作用,我们利用小鼠肺腺癌LLC细胞（含有KRASG12C突变）移植瘤模型进行探究,并取得以下结果:1.Cck-8实验结果显示Cul4b敲低细胞（shCUL4B）和对照细胞（NC）体外增殖无统计学差异。无胸腺裸鼠移植瘤实验结果显示,二者形成的移植瘤在体积、重量上均无统计学差异,并且移植瘤内Ki67+细胞数目也无统计学差异,但shCUL4B组移植瘤内Gr-1+细胞数目显著增加。2.利用免疫健全的C57小鼠荷瘤实验发现,shCUL4B组移植瘤显著大于对照组。流式细胞术结果显示,与对照组相比,shCUL4B组移植瘤中CD4+和CD8+T细胞数目显著减少,MDSCs数目显著增加。3.Gr-1中和抗体和吉西他滨可拯救由Cul4b敲低引起的促进C57小鼠移植瘤生长作用,并且Gr-1中和抗体和吉西他滨能有效降低shCUL4B移植瘤内MDSCs 比例,增加CD4+和CD8+T细胞比例。第三部分:CUL4B通过表观遗传调控抑制Cxcl2转录而限制MDSCs募集为明确肿瘤细胞CUL4B缺失促进MDSCs募集的机制,我们进行以下研究:1.通过尾静脉注射PKH26标记的骨髓细胞观察肿瘤募集MDSCs的能力,实验结果显示,与KrasG12D小鼠相比,Cul4b敲除的KrasG12D小鼠肺募集的PKH26-MDSCs数目显著增多。体外趋化实验显示,从敲低Cul4b的LLC细胞收集的条件培养基比来自对照细胞的条件培养基具有更强的MDSCs趋化作用。2.转录组测序结果显示,Cul4b敲除导致KrasG12D小鼠肺上皮细胞中Il1β、Ccl3、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl5、Ccl4、Csf3、Ccl2以及Il6等细胞/趋化因子表达上调,并在Cul4b敲低的LLC细胞中得到了类似结果。3.蛋白芯片分析显示,与对照细胞相比,敲低Cul4b的LLC细胞条件培养基中CXCL2表达水平显著上升。ELISA及Western blot实验分析证实,敲低/敲除Cul4b的LLC细胞、KRAS突变肺上皮细胞、KRAS突变小鼠肺泡灌注液中均检测到CXCL2的表达量显著高于对照组。而在无肿瘤Cul4b敲除小鼠的肺泡灌注液中未检测到CXCL2表达增加。4.为进一步明确肿瘤细胞缺失CUL4B引起的促进KRAS突变肿瘤生长是通过增加的CXCL2分泌介导的,我们利用CXCR2拮抗剂SB-265610进行了拯救实验。结果发现,抑制CXCR2能有效逆转由CUL4B下调引起的促瘤作用。流式细胞术分析结果显示,SB-265610能显著减少CUL4B低表达肿瘤微环境内MDSCs,增加CD4+和CD8+T细胞。5.ChIP实验结果显示,CUL4B在Cxcl2转录起始位点上游-485～-295 bp处有结合。进一步的研究发现,CRL4B复合物协同HDACs复合物通过催化H2AK119单泛素化和组蛋白H3去乙酰化抑制Cxcl2的转录。结论1.肿瘤细胞缺失CUL4B重塑KRAS突变介导的肺腺癌肿瘤微环境,主要表现为MDSCs增多,CD4+和CD8+T细胞减少,血管生成增加。2.肿瘤细胞缺失CUL4B引起的KRAS突变介导的肺腺癌生长加速是通过增加MDSCs招募介导的。3.CRL4B复合物通过单泛素化H2AK119并协同HDAC1/2/3抑制Cxcl2的转录,缺失CUL4B导致Kras突变肺腺癌细胞CXCL2表达上调,促进MDSCs的募集,进而加快肿瘤进展。