背景与目的构成人体的每一个细胞内都有全套基因的核苷酸序列,这些基因可以编码机体构成所必须的全部部件,然而这些基因的编码序列并不是都有活性,有活性的基因在整套基因中仅占少数,大部分处于表达失活状态。基因的表观遗传修饰有协助控制基因表达活性的作用,以保证基因在准确的空间和时间发挥或抑制表达。DNA甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化,使核酶、限制性内切酶失去识别位点而失去转录活性。DNA甲基化作为一种非常重要的表观遗传修饰方式,具有着双重作用：一方面,它能够保持基因组的稳定性；另一方面,它同时也可以保持基因表达在空间与时间上的特异性。DNA甲基化是甲基转移酶把甲基选择性地转移到胞嘧啶上构成5-甲基胞嘧啶的过程,一般发生在CpG二核苷酸的C上。DNA复制后,甲基化酶可基本稳定地将亲代DNA的甲基化状态复制到新形成的DNA中,把未甲基化位点进行甲基化,如此甲基化模式可以代代相传。DNA甲基化会因内外环境的变化而发生改变,把环境作用和机体反应联系在一起。DNA甲基化从发现之后,就被大量地列入研究日程。人们已经建立了许多DNA甲基化水平的检测方法。目前存在的检测方法,概括起来可分为三类,分别用于基因组总体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的探查。本研究的切入点在于单个CpG位点甲基化水平的检测。已存在的特异位点甲基化水平定量的方法比较常用的有焦磷酸测序、荧光素标记的探针检测技术、荧光能量共振转移技术和一种实时定量PCR甲基化检测技术,这些技术整体上给特异位点甲基化检测留下了操作复杂,仪器和设备成本高,定量结果偏差较大等缺陷,新技术的产生可为甲基化研究提供有利的工具。为此,本研究在亚硫酸氢钠转换和PCR扩增基础上,建立了名为甲基化特异的单核苷酸标记延伸技术(Bisulfite conversion-specific one-label extension, BS-OLE)的甲基化检测新方法。基于单核苷酸引物延伸的原理,BS-OLE技术使用BS-引物与目标位点上游紧临的序列结合,然后荧光标记的dCTP或dUTP通过单碱基延伸而分别掺入到引物下游的以甲基化形式(CpG)或非甲基化形式(TpG)存在的目标位点上,以产物的荧光偏振值(Fluorescence polarization, FP)高低来确定待测DNA目标序列中CpG位点的甲基化水平。人类基因组大约有一半来源于转座子,它们也被称为跳跃基因,可以从基因组中任何一个位置转移到另一个位置,这种转移可以发生在染色体内,也可以发生在染色体间。转座子的活动,会影响基因组的稳定性,产生突变或积累成新基因,进而促进人类基因组的遗传革新。LINE1和Alu-Y均是人类基因组中最常见、最丰富、最活跃的转座子。LINE1大约有50万个拷贝,Alu-Y大约有100万个拷贝,在这数量庞大的转座子中,仅有少数序列完整的有转位活性,大部分处于失活状态,然而因为它们在DNA中所占比例很高,LINE占17%,Alu-Y占11%,所以在基因组里具有非常重要的位置。LINE1和Alu-Y甲基化已被用作全基因组甲基化水平的生物标志物,分析它们与一些疾病的相关性,如肺癌、结肠癌、局部缺血性心脏病(Ischemic Heart Disease, IHD)、肾细胞癌等。精神分裂症和双相情感障碍是两种常见的精神病,由于高发率和极低的治愈率,给社会和家庭带来沉重的负担。精神分裂症患者表现出一系列临床症状,如偏激、妄想、幻想、认知损伤、情感障碍、意志行为障碍等。双相情感障碍是一种兼有躁狂状态和抑郁状态的精神病,这两种状态可在同一病患身上反复交替发作,仅在间歇期病人才是正常的。虽然遗传性在发病因素占很重要的位置,但是同卵双生子的发病一致性远远没有达到100%,这表明非遗传因素在病因学中也占据着非常重要的位置。本项研究以LINE1元件的甲基化为示例,建立基于荧光偏振检测的甲基化特异的单核苷酸标记延伸技术(BS-OLE),检测单个CpG位点甲基化的方法。利用此BS-OLE方法,检测精神病包括精神分裂症和双相情感障碍外周血样本中LINE1和Alu-Y亚家族的甲基化修饰的变化情况,筛选与疾病相关的DNA甲基化位点,从表观遗传角度阐述这两种精神病的发病机制。材料与方法1.实验材料(1) BS-OLE甲基化检测方法的建立所用材料用外周血细胞全基因组DNA、重组质粒DNA、5-aza-dCTP处理过的HEK293T细胞DNA分别对BS-OLE甲基化检测方法实行稳定性、准确性验证。这些材料都用试剂盒提取,溶解在TE溶解液中,保存于-20±。重组质粒构建所用载体为pMD18T载体,感受态细胞为DH-5α。常规培养的M059K人神经胶质瘤细胞、人骨肉瘤细胞U20S、人胶质母细胞瘤T98G细胞、A172胶质母细胞瘤细胞、U87人脑星形胶质母细胞瘤细胞、HEK293T细胞的基因组DNA用试剂盒提取,溶解在TE溶解液中,保存于-20±,用于BS-OLE甲基化检测方法在小样本中的应用实验。(2) BS-OLE甲基化检测方法在精神病分析中的应用所用材料抽取92例精神分裂症患者、99例双相情感障碍患者和92例正常对照的静脉外周血,用传统酚一氯仿法提取基因组DNA,溶于TE溶解液中,保存于-20±作为测试样本,用于分析LINE1和Alu-Y上特异位点甲基化水平与精神分裂症和双相情感障碍的相关性。2.实验方法(1)DNA甲基化转换用偏重亚硫酸钠盐处理DNA完成甲基化转换,被处理的DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)因脱氨而转变成尿嘧啶(U),经过PCR扩增后会变成胸腺嘧啶(T),被处理的DNA中发生甲基化的胞嘧啶(C)则保持胞嘧啶的形式不变,经过PCR扩增后仍然是胞嘧啶(C)。那么,对原DNA甲基化的检测就转变为,对PCR扩增产物中目标位点上胸腺嘧啶T和胞嘧啶C含量的比较。(2)PCR扩增和酶切扩增原来少量的目的片段,并将产物酶切,去除残留的引物和dNTP,作为后继实验的材料,可减少对基因组DNA原材料的需求,酶切消除了扩增试剂对下游实验的影响。(3) 重组质粒的构建从甲基化转换后的外周血DNA扩增出转座子LINE1启动子区的一段保守序列,将其与pMD18T载体连接,转化入DH-5a感受态细胞,短时培养后涂板,从平板上的菌落中挑选出目标位点上基因型分别为T和C的单克隆。(4) CORB A (Combined Bisulfite Restriction Analysis)实验这个实验用来与BS-OLE方法相互验证。用核酸限制性内切酶TaqI酶切甲基化水平分别为0%,20%,40%,60%,80%,100%样本的PCR产物,将识别序列TCGA中胞嘧啶被甲基化的样本的产物切断,识别序列TCGA中胞嘧啶未被甲基化的样本的产物,由于序列已由原来的"TCGA"变成"TTGA"而不能被切断。把酶切产物跑琼脂糖电泳,根据电泳条带的灰度确定识别位点甲基化水平。(5) 病例对照分析实验用自己建立的BS-OLE检测方法,定量精神分裂症、双相情感障碍和正常对照这三个实验组受试对象全基因组LINE1和Alu-Y上的几个特异CpG位点的甲基化水平,分析比较这三个实验组间各个被测位点甲基化水平的差异,分析它们与精神病间的相关性。在分析中,视对照样本的甲基化水平为标准值,将其换算成100%,然后以相同比例将精神分裂症组和双相情感障碍组甲基化水平进行换算,再比较三者之间的差异。3.统计分析数据的统计学处理,使用的是IBM SPSS Statistics 20软件。用相关性分析年龄和性别与甲基化之间的关系。由于所用样本年龄不符合正态分布,所以在实验组间比较时,采用协方差分析,性别为等级变量,年龄为连继变量。所有的分析都是双侧分析。当P<0.05时统计结果达到显著性水平。主要结果BS-OLE方法的稳定性、准确性很好。理论值为25%的甲基化水平,用此方法检测得到32.7±0.5%的甲基化水平,与理论值相差不大。在准确性实验结果中,理论值为20%、40%、60%和80%的甲基化水平,用此方法检测得到25.6±4.5%、39.8±3.9%、53.3±4.8%和75.7±2.2%,用COBRA方法测得甲基化水平分别为23.0±0.0%、44.5±2.5%、61.5%±2.5%、77.5±5.5%,这两种方法结果的符合度很高。BS-OLE方法可检测出用5-aza-dC培养的HEK293T细胞的甲基化水平随5-aza-dC的浓度增加而减少。将此方法应用于细胞水平甲基化检测时,分别得到常规培养的癌细胞Y87、M059K、A172、U2OS、T98G和HEK293T的甲基化水平为48.7%±1.7%、41.4%±2.8%、39.3%±0.6%、33.7%±3.0%、30.9±1.6%和37.2±4.1%。正常对照、精神分裂症和双相情感障碍中LINE1上的3个CpG位点和Alu-Y上的4个CpG位点,共七个CpG位点,各位点与年龄及性别的相关性分别不同。正常对照样本、精神分裂症样本和双相情感障碍样本之间的甲基化差异,无论是整体差异,还是男性样本之间或女性样本之间,在不同位点上甲基化差异的表现均不相同,但大部分CpG位点上这三组样本间甲基化水平差异达到显著性水平。有趣的是,在A3位点上,正常样本、双相情感障碍样本和精神分裂症样本的甲基化水平依次增加,差异都达到了显著水平。主要结论1. 以单碱基延伸为基础建立的名为甲基化特异的单核苷酸标记延伸技术(BS-OLE)的特异位点甲基化水平检测方法的准确性、稳定性均表现突出,是一种简单可靠的新方法。2. LINE1和Alu-Y元件上都存在着与精神分裂症和双相情感障碍相关的特异CpG位点,尤其体现在Alu-Y元件上的A3处。A3有成为精神病诊断指标的可能。3.从LINE1角度来看,精神分裂症和双相情感障碍患者甲基化水平都比正常人的低。