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假交替单胞菌作为一类典型的海洋细菌,在海洋环境中分布广泛。本研究对两株不同海域来源的,产灵菌红素的假交替单胞菌SCSIO6842和DSM6842进行了亲缘关系鉴定,发现这两株菌株属于同属同种中的不同亚种;对其表型特征进行分析,发现其表型特征如生物被膜形成等存在明显的差异;同时,通过全基因组序列比对分析,发现其基因组序列存在着区域性差异,而且这些差异主要为可遗传元件如转座酶和基因岛;尤其SCSIO6842携带了一个内源质粒pMBL6842,而DSM6842中不存在质粒。 利用我们实验室建立的适合假交替单胞菌的遗传操作体系,成功得到了质粒pMBL6842的缺失突变株;表型分析发现质粒的存在能够增加宿主对外源质粒的抗性。进一步分析发现,质粒为潜在的接合转移型质粒,并携带一对潜在的毒素-抗毒素系统和一个DNA结合蛋白H-NS。因此,对于质粒pMBL6842的研究我们开展了如下的工作: 1.质粒pMBL6842中Ⅱ型毒素-抗毒素系统的鉴定及调控研究。实验证实了毒素CopT属于ParE家族蛋白并具有细胞毒性,而抗毒素CopG是含有RHH结构域的CopG家族蛋白;抗毒素CopG通过与CopT直接相互作用来拮抗CopT的毒性。CopTG的缺失导致质粒pMBL6842的拷贝数由1个增加到60个,而CopT的缺失并不能影响质粒的拷贝数;通过回补实验也证实了回补CopG时,质粒的拷贝数明显降低,由此推测CopG调控了质粒的拷贝数。CopG不仅能结合自身的启动子而且还能结合rep的启动子;因此,CopG是通过调控rep的转录水平来调控质粒的拷贝数。CopG极不稳定,并且降解是从羧基端开始的,逐级降解为更小的蛋白;但是CopG的降解保留了完整的DNA结合能力而失去了与毒素蛋白的结合能力。基于抗毒素的不稳定性和毒素的稳定性,建立了毒素蛋白纯化的新体系,并鉴定了毒素CopT的功能为DNA促旋酶抑制剂。此外,CopTG通过介导对抗氧化压力及生物被膜形成等赋予宿主生存优势。毒素-抗毒素系统在不同环境中的功能和调控认识的深入将有利于我们从进化角度分析毒素-抗毒素系统系统与环境适应性的关系,以及此系统与质粒等可移动遗传元件的共进化关系。 2.H-NS为全局性调控因子,调控宿主大量基因。通过H-NS过表达转录组分析,结果表明H-NS调控宿主SCSIO6842中大量的基因。对差异性表达的基因进行分析,发现H-NS结合启动子区的17 bp保守序列。此外,对hns缺失突变株进行分析,发现H-NS能增加宿主的生存优势,并能促进生物被膜形成和抗氧化胁迫能力但是降低了宿主的运动性能。因此,H-NS在赋予宿主生存优势的同时,调控着宿主的大量基因来维持宿主体内的代谢网络的平衡。H-NS是全局性调控因子,揭示质粒上来源的H-NS如何调控宿主的基因表达能够揭示宿主与外来元件的协同进化关系。