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研究背景随着肝移植技术的日益成熟,供肝短缺已成为比移植后排斥反应、外科并发症以及感染更为严峻的全球性问题,由此导致边缘性供肝的使用逐渐增加[1]。但是,边缘性供肝对缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)极其敏感,导致此类肝移植受者的预后很差[2],严重时可危及患者生命。目前许多针对IRI的防治方法效果均有限,难以满足临床需求,因此需要寻找针对肝脏IRI新型的更为有效的治疗方案。一氧化碳(Carbon monoxide,CO)是一种十分重要的细胞信使分子,具有抗炎、抗凋亡等作用,最近的研究发现CO可能还参与影响细胞的自噬过程。目前关于自噬在肝脏IRI中的作用方式尚不明确,其具体机制研究较少。目的:本实验利用体外肝实质细胞低浓度血清培养和缺氧复氧模型,以及体内肝脏缺血再灌注损伤模型,深入探讨可溶性一氧化碳释放分子CORM-2在肝脏IRI中的作用及可能的新机制。方法:1.模拟严重肝损伤时的缺血微环境,在体外建立肝前体细胞WB-F344低浓度(4%)血清培养模型,探讨CORM-2治疗对WB-F344细胞活性和增殖的影响,初步研究在应激环境中自噬对肝实质细胞的作用。实验分为五组:10%FBS组;4%FBS组;4%FBS+iCORM-2组;4%FBS+CORM-2组以及4%FBS+CORM-2+3-MA组。CCK-8检测细胞活力和增殖情况;吖啶橙染色检测自噬小体的形成情况;Western-Blot检测AKT、p-AKT、p-mTOR、HO-1、自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II的表达情况;2.分离原代大鼠肝细胞,在体外检测CORM-2治疗对肝细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响,并探讨自噬在肝细胞H/R中的作用。实验分为四组:DMSO空白对照组;无活性iCORM-2阴性对照组;CORM-2实验组以及CORM-2+3-MA自噬抑制组。采用两步胶原酶灌注法分离细胞,观察原代大鼠肝细胞贴壁情况,台盼蓝染色检测细胞活性状态,取生长状态良好的原代肝细胞,在体外缺氧条件下培养4小时,并经历复氧过程。收集各组细胞培养液上清,用全自动生化仪检测细胞培养上清中的谷草、谷丙转氨酶指标变化评价细胞损伤程度;Western-Blot检测自噬相关蛋白LC3-I和LC3-II的表达,判断细胞自噬水平改变;3.建立大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型,在体内检测CORM-2治疗对肝脏IRI的影响。实验随机分为Sham组和IRI组,每组分别给予Vehicle和CORM-2治疗。大鼠术前禁食,在环境温度26℃下,Sham组仅做腹部切开,立即取血样和肝脏标本;IRI组应用显微血管夹阻断肝左、肝中叶脉管的血供,造成肝左叶与肝中叶缺血,即70%肝组织缺血。IRI组血流阻断1h后开放,分别于恢复血流后1h和6h处死大鼠,并留取血样和肝脏标本。全自动生化仪检测谷丙、谷草转氨酶变化评价肝功能变化。肝组织行HE和TUNEL染色评价肝损伤程度;实时定量PCR检测组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达变化评价组织炎性反应;Western-Blot测定LC3-I和LC3-II蛋白的表达情况,评价组织自噬活性;4.利用自噬抑制剂3-MA联合CORM-2治疗,反向验证自噬在肝脏IRI中的作用。重建大鼠70%肝脏IRI模型,于术前1h静脉给予3-MA联合CORM-2治疗,对照组仅给予CORM-2。于恢复血流后6h处死大鼠,留取血样和肝脏标本,检测谷丙和谷草转氨酶变化评价肝功能;肝组织行HE染色检查评价组织损伤程度;Western-Blot测定LC3-I和LC3-II蛋白的表达变化,检测组织自噬发生情况。结果:1.4%FBS培养条件下,WB-F344细胞生长相对缓慢,细胞活性和增殖能力下降;CCK-8结果提示CORM-2治疗能提高WB-F344细胞活性,促进其增殖;吖啶橙染色显示,CORM-2治疗使胞质内橘红色荧光增强,提示细胞自噬小体形成活跃;同时Western-Blot结果显示p-AKT、p-mTOR表达下调,HO-1蛋白表达增加,LC3-II/LC3-I的比值显著增大;3-MA干预后,CORM-2治疗效果被逆转。2.原代分离的大鼠肝细胞状态良好,24小时后细胞均实现贴壁,台盼蓝染色显示细胞存活率达90%以上。在缺氧/复氧培养条件下,细胞培养上清中可检测到谷丙和谷草转氨酶释放,提示细胞出现明显应激损伤;在给予CORM-2治疗后,生化检测发现培养上清中谷丙和谷草转氨酶释放减少,同时Western-Blot结果显示LC3-II的表达增加,而LC3-I的表达下调;3-MA干预后,CORM-2治疗效果被逆转。3.大鼠肝脏经历缺血再灌注后出现严重的肝功能损害,血清谷丙和谷草转氨酶水平明显升高;CORM-2预处理使再灌注后1h和6h两个时间点的谷丙、谷草转氨酶水平明显降低,提示肝功能损伤程度减轻;组织学检查发现IRI可使肝实质细胞发生凋亡坏死,而CORM-2治疗可显著减轻肝组织中的细胞凋亡;实时定量PCR发现,IRI肝组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达上调,而给予CORM-2治疗后其表达水平降低;Western-Blot结果提示CORM-2治疗可使LC3-II的表达增高,LC3-II/LC3-I的比值显著增大。4.同CORM-2组比较,给予自噬抑制剂3-MA联合CORM-2治疗后,血清中谷丙和谷草转氨酶出现反跳升高,提示CORM-2的肝脏保护作用被解除;组织学检查亦证实,3-MA可导致肝组织炎性反应加重,肝实质细胞坏死增多;Western-Blot结果显示3-MA处理后自噬相关蛋白LC3-II表达降低,而LC3-I分子表达增高,自噬被抑制。结论:一氧化碳释放分子CORM-2通过释放CO有利于维持应激环境下WB-F344细胞的活性和增殖能力;同时,CORM-2治疗可减轻体外培养大鼠肝细胞的缺氧/复氧损伤;此外,CORM-2可在体内环境中减轻肝组织缺血再灌注损伤,发挥肝脏保护作用。其机制可能是通过抑制AKT/mTOR信号轴,诱导细胞产生自噬,抑制细胞凋亡,而HO-1可能也参与了此过程。