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目的:近年来,在冠脉介入治疗及冠脉搭桥术、心脏外科体外循环等治疗中,许多组织器官缺血后重新得到血液再灌注。多数情况下,缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复,损伤的结构得到修复,患者病情好转康复;但是有时在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重,甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤的发生机制尚未彻底阐明。目前认为活性氧自由基的作用是缺血-再灌注损伤的重要发病学环节。在体外实验中,可以使用H2O2刺激大鼠乳鼠心肌细胞来模拟活性氧损伤。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的非编码RNA,它们能够通过与其靶基因mRNA的3’UTR区互补,在转录后水平上抑制它们靶基因的翻译。microRNA-208a（miR-208a）是一个在心肌中特异性表达的microRNA,种属间高度保守。因此推测,miR-208a具有如此高的心肌特异性,必定与心肌的特性有关。有文献报道,心肌梗死患者的血浆中,miR-208a的表达量明显增高。活性氧自由基生成增加产生的氧化应激以及由氧化应激触发的心肌细胞凋亡,是多种原因诱导的缺血-再灌注发生发展的共同基础。此外,在心肌缺血/再灌注损伤中,miR-208的表达量也有改变。在心肌缺血/再灌注损伤中会产生大量的活性氧自由基,从而引起心肌细胞凋亡,加重心肌损伤。细胞凋亡是心肌缺血/再灌注损伤的病理特征之一,而且是损伤早期的主要死亡方式。因此,本课题主要探究miR-208a在心肌中保持如此高的表达量的原因,以及其生物学功能和潜在的分子生物学机制。方法:（1）首先,构建大鼠心脏缺血再灌注模型,再灌注损伤后取损伤处心脏组织以及损伤远端处心脏组织,使用组织研磨器将组织块研磨为细胞匀浆,再利用qRT-PCR的方法对miR-208a的表达进行检测。为了检查miR-208a在细胞对H2O2刺激的反应中的作用,用不同浓度的H2O2处理了心肌细胞。再利用qRT-PCR的方法对miR-208a的表达进行检测。为了研究miR-208a是否参与ROS诱导的细胞凋亡,通过用化学合成的miR-208a模拟物（miR-208 Mimic）转染心肌细胞以增强内源性miR-208a功能;或用化学合成的片段与miR-208a（miR-208a KD）的反向互补序列减弱内源性miR-208a效应,来建立过表达和敲低系统。（2）成功分离并培养新生大鼠心肌细胞用于机理研究。使用将外源性H2O2加入到培养的心肌细胞中,并在miR-208a过表达或敲低体系中,通过荧光染料CM-H2DCFDA检测到ROS水平。此外,使用ELISA测定用于检测培养基中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的分泌水平。（3）通过FITC-Annexin V/PI染色和流式细胞仪检测改变miR-208a的表达是否可以阻止H2O2诱导的细胞凋亡。并且还检测了凋亡相关蛋白标记物的活性,即凋亡标记蛋白caspase-3和PARP在H2O2处理的心肌细胞中的切割活性（4）通过生物信息学预测分析寻找miR-208a的潜在靶标,并且使用western blot法检测H2O2诱导的心肌细胞凋亡中潜在靶标的表达趋势是否与miR-208a相关。此外,将含有miR-208a结合位点的靶标的3’UTR克隆到荧光素酶报告质粒pmiR-REPORT Luciferase载体中,并使用荧光素酶报告技术验证潜在靶标是否确实为miR-208a的靶标。（5）为了阐明PTPRG和PTPN4在心肌细胞中的生物学功能,分别用过表达PTPRG或PTPN4的腺病毒感染心肌细胞,并使用western blot的方法进行了确认,FITC-Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率。使用siRNA对这两个基因进行敲低,并在心肌细胞中转染miR-208a抑制剂,然后进行流式细胞术检测细胞凋亡率,同时使用ELISA法检测培养基中SOD和CAT的分泌水平。结果:（1）在I/R刺激后观察到miR-208a mRNA水平的明显下调,然而,α-MHC的变化没有显著性。将心肌细胞暴露于不同浓度的H2O2处理6小时,发现H2O2导致心肌细胞中miR-208a的表达降低。为了研究miR-208a是否参与ROS诱导的细胞凋亡,构建了miR-208a的过表达或敲低体系,并使用qPCR进行了验证。（2）将外源性H2O2加入到培养的心肌细胞中,检测到高水平的ROS。miR-208a过表达时ROS水平几乎没有变化,然而,当miR-208a在心肌细胞中被敲低时,检测到ROS水平显著降低时。同时,ELISA结果表明miR-208a敲低组中SOD和CAT水平均增加。（3）实验发现miR-208a的敲低可以显著降低H2O2诱导的发生率,miR-208a的过表达促进了心肌细胞凋亡的发生。Western blot结果显示miR-208a敲低显著减轻了PARP和caspase-3的切割,而miR-208a模拟显著增强了caspase-3和PARP切割活性（4）使用Targetscan在线软件（http://www.targetscan.org）预测得到3个PTP,PTPRG,PTPDC1和PTPN4是miR-208a的潜在靶标。最重要的是,当测试用400μMH2O2处理的培养的大鼠心肌细胞中miR-208a和靶基因的表达水平时,发现miR-208a和PTPRG与PTPN4之间存在显著的负相关。通过操纵miR-208a在心肌细胞中的表达,发现miR-208a过表达可以下调PTPRG和PTPN4的蛋白水平,而miR-208a的敲低可以增加PTPRG和PTPN4的蛋白水平。在与荧光素酶报告质粒和miR-208a Mimics或Scramble共转染后,发现miR-208a的上调分别显著降低了野生型PTPRG 3’UTR和PTPN4 3’UTR的荧光素酶活性,然而,当野生型PTPRG 3’UTR和PTPN4 3’UTR改变为突变PTPRG 3’UTR和PTPN43’UTR时,这种现象明显逆转。（5）通过Western印迹分析,发现腺病毒转染后,PTPRG和PTPN4蛋白水平显著上调。流式细胞术结果显示PTPRG和PTPN4有助于抑制心肌细胞凋亡,并可逆转miR-208过表达诱导的促凋亡作用,同时,两种基因的敲低可以逆转miR-208a抑制剂诱导的抗细胞凋亡作用。通过拯救实验,解释了抗miR-208a可以通过上调内源性PTPRG和PTPN4蛋白水平来降低ROS水平并抑制细胞凋亡率。最后,证实当PTPCG和PTPN4过表达时,培养基中SOD和CAT的分泌水平增加,而相反,当PTPCG和PTPN4时,SOD和CAT的分泌水平降低。结论:在本研究中,报告了miR-208a在心肌I/R损伤中的作用以及潜在的心脏保护机制。内源性miR-208a的敲低显著降低了细胞ROS水平并降低了心肌细胞凋亡,外源性miR-208a过表达可增加心肌细胞的ROS水平,并增强细胞凋亡。此外,PTPRG和PTPN4参与调节细胞蛋白酪氨酸磷酸化平衡水平,通过生物信息学预测以及荧光素酶报告技术,验证PTPRG和PTPN4为的miR-208a靶基因。总之,研究表明miR-208a在ROS诱导的心脏细胞凋亡中起着关键的保护作用。