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通过对峙平板拮抗实验、DNS(3,5-二硝基水杨酸)比色法和胶体几丁质平板透明圈实验从在云南境内采样、分离、初筛和复筛获得高产几丁质酶和对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)97Aa003具有强拮抗活性的木霉菌株THS-1,对该菌株产生的几丁质酶的种类、理化特性及其对烟草赤星病菌的作用机制进行研究。 通过摇瓶发酵可诱导木霉菌株THS-1产生高活性和高酶量的几丁质酶,90%饱和度的硫酸铵的分级沉淀、离子交换层析(阴离子层析预装柱:SOURCE15Q PE 4.6/100)对几丁质酶进行分离和初步鉴定。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,纯化的几丁质酶包括2个组分,分子量分别约为40kD和70kD,它们能共同作用并催化降解胶体几丁质成单体即N-乙酰氨基葡萄糖,这两种木霉几丁质酶与已经报道的哈茨木霉(Trichoderma harziaum)的分子量为41kD的内切几丁质酶(endochitinase)和分子量为72kD的几丁二糖酶(chitobiase或N-acetyl-glucosuminidase)基本一致。 酶学特性研究表明,这两种几丁质酶共同作用并催化降解胶体几丁质成单体N-乙酰氨基葡萄糖的最适温度为50℃,其适应范围在40-55℃;最适pH值为4.5和7.0,但它们表现出较广的pH值适应范围(3.5-8.0)。 通过指形管培养法分别测定几丁质粗酶浓缩液和纯化的几丁质酶液对赤星病菌97Aa003的孢子萌发的抑制作用。几丁质粗酶浓缩液在较高浓度下(25.2U)处理的孢子液在48小时内强烈抑制病菌孢子的萌发,抑制率达90%以上,中浓度(12.6U)在12小时后其孢子萌发率开始增加,48小时达到50%以上,而低浓度(6.3U)的粗酶液在保温培养8小时后其萌发率开始增加,12小时近50%,24小时达到100%。对照在4小时后孢子萌发率就达到100%,萌发的芽管发育正常,生长迅速,并形成菌丝体;而处理的孢子液不萌发或萌发的孢子芽管顶端变成钝园状,生长缓慢或停止生长,显微观察表明酶处理的孢子及芽管畸形,并能看到有些孢子细胞壁破裂,细胞质外溢。纯化的几丁质酶液(9.4U)与酶活性相近的粗酶液(12.6U、6.3U)比较,在48小时内,其对孢子萌发的抑制率最高达66.9%,然后抑制作用逐渐减弱,下降到20.7%,而12.6U的粗酶液在24小时内一直保持85%以上的抑制率,到48小时仍达近50%,6.3U在8小时内对赤星病菌孢子萌发的抑制率保持在90%以上,到达12小时仍保持50%以上,萌发芽管的长度也较浓缩液同期的要长。 采用抱子液悬滴法接种烟苗(K-326)叶片测定木霉几丁质粗酶液抑制赤星病菌抱子的致病性,较高浓度的几丁质粗酶液(19.5 U/ml、9.SU/ml) 处理的赤星病菌泡子接种4天和7天后病斑面积(以病斑直径为指标)比对照分别减少40%和 60O,而较低浓度(4。gU/m)处理的赤星病菌抱于接种 4天和 7天后病斑的减少率分别为20%和40%。 总之,桔抗烟草赤星病菌的生防菌株木霉THS1能够产生几丁质酶,该酶能够强烈抑制病菌抱子萌发、对寄主的侵染,抑制效果与酶的浓度和酶量正相关,纯化的几丁质酶液与粗酶液具有相同的作用,但效果较弱,纯化的几丁质酶包括分子量约为 40 kD和 70kD两个组分。