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临床上及早发现基因突变对肿瘤的个体化治疗有着非常重要的意义。目前，常规PCR+Sanger测序检测突变应用最为广泛，但该法只能检测含量在15％-20％以上的突变基因，并且操作繁琐、价格昂贵，其它方法也各有不足，现缺少一种简便、快速、价廉、灵敏、仪器常见、可同时对多个突变位点进行初步筛查的方法。为解决上述问题，本文采用基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR（coamplification at lower denaturation temperature-PCR）用于快速KRAS突变的筛查。其中，COLD-PCR利用DNA双链的熔解温度与其序列相关的性质，通过改变变性温度，能在大量野生型基因中选择性地富集突变基因;Taqman探针联合DNA结合染料法是指在实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)反应体系中同时加入DNA结合染料和针对野生型序列的Taqman探针用于终点荧光信号的检测。该技术可选择性富集和筛选与野生型探针不匹配的各种突变，即可同时筛选多种突变，而不论突变是已知或未知、单个或多个、点突变还是长串突变。KRAS基因突变被发现广泛存在于包括肺癌在内的多种癌症，检测KRAS突变的临床意义重大，本文通过对肺癌中KRAS基因突变的检测探讨该方法的可行性。 目的:建立基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR法检测KRAS基因突变，验证其可行性，并应用于临床样本中KRAS突变的快速筛查。 方法:1.选取KRAS纯合野生型和纯合突变型细胞株;设计特异的引物、针对KRAS野生型序列的探针及突变型序列的探针（均用ROX标记）;提取细胞株DNA，用常规PCR扩增，产物测序验证基因型。 2.用染料(EVAgreen) qPCR法分别扩增KRAS突变型和野生型DNA，逐渐降低变性温度，以突变DNA有扩增而野生DNA基本无扩增时的变性温度为COLD-PCR的最佳严格解链温度(critical denaturation temperature，Tc)，建立COLD-PCR循环条件。 3.在染料qPCR体系中加入野生型探针，优化体系及常规PCR循环条件，建立Taqman探针联合DNA结合染料的常规qPCR法（方法一）。 4.在方法一的基础上，将常规PCR循环条件改为COLD-PCR，建立基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR法（方法二）。 5.用两种方法分别扩增不同KRAS突变比例的标准品，记录EVAgreen染料与ROX标记探针的终点荧光强度并计算EVA/ROX比值，分别统计分析三组EVA/ROX的平均值及标准偏差，计为means+SD。以能准确检测到区别于纯野生型KRAS基因EVA/ROX值的最小EVA/ROX值所对应的标准品比例为最低检测限。 6.将两种方法中的野生型探针换成突变型探针，分别扩增不同KRAS突变比例的标准品，观察染料及突变探针的荧光强度及趋势，验证方法一、二可行性。 7.收集25例肺癌患者血样、提取DNA，用两种方法分别检测KRAS突变。检测有KRAS突变的血液样本，取其余下DNA用常规PCR试剂盒，以常规PCR或COLD-PCR循环条件扩增，再Sanger测序，精确验证是否有KRAS突变。 结果:1.测序结果验证了两细胞株均含预期基因型。COLD-PCR时的Tc值为80.5℃。 2.两方法检测不同比例KRAS突变标准品，得到了终点信号EVA/ROX的means±SD，方法一和方法二最低检测限分别为10％、5％。比较两方法的最低检测限可得:与常规PCR循环条件相比，COLD-PCR条件下能更好的富集突变。 3.两方法中野生型探针替换成突变型探针后，观察到染料和突变探针的荧光强度及趋势均符合预期，验证了两方法的可行性。 4.25例血液样本中，方法一未检出KRAS突变，方法二检出一例有KRAS突变，分析该样本EVA/ROX的比值，对比方法二标准品的比值，可以半定量的判断该样本KRAS突变比例在5％-10％之间。 5.方法二检出有KRAS突变的血样，常规PCR条件扩增的产物测序未见KRAS突变，COLD-PCR条件扩增的产物测序有KRAS突变。不但证实了方法二的准确性，还说明与常规PCR相比，COLD-PCR能更好的富集突变，提高了下游测序检测突变的敏感性。 结论:1.本研究成功建立了基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR法，最低检测限为5％，比常规PCR+Sanger测序法的15％-20％高。该方法能用血液样本，具有无创性以及简便、快速、价廉、灵敏、仪器常见等特点，原理上能同时筛选多种突变，可用于KRAS突变的快速筛查。 2.与常规PCR相比，COLD-PCR能更好的富集突变，提高了下游测序技术检测突变的敏感性。基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR法初筛后有突变的样本可将余下DNA行COLD-PCR，产物测序，达到精确检测突变的目的。