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革兰氏阴性病原菌杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)会引起多种鱼类的出血性败血症并造成巨大的经济损失,因此详细了解其致病机制有助于找到更加安全有效的防治方法。目前对于E.piscida的致病机制研究主要集中在重要的毒力蛋白分泌系统,即Ⅲ型分泌系统(T3SS)和Ⅵ型分泌系统(T6SS)以及调控T3SS/T6SS表达的双组分系统EsrA-EsrB上。在研究中,我们通过转录组分析发现响应调节子EsrB的功能已不仅仅局限于对毒力的调控,更参与着E.piscicida中其他重要的生长代谢与环境适应相关的途径。进一步多角度研究EsrB在E.piscicida生长和环境适应等途径中的作用,有助于我们更加深入和全面地了解E.piscicia感染机制。实验中,当E.pisicicida EIB2O2在DMEM培养基中培养时,esrB以及T3SS/T6SS的相关基因可以正常表达;当培养在LB中时,T3SS/T6SS相关蛋白却没有被检测到。我们通过转录融合荧光检测的方法,证明LB培养条件下esrB基因可以被转录;利用比较蛋白质组学分析发现EIB202野生株和△esrB在DMEM或LB培养条件下的全菌蛋白质谱差异,找到了 28个可能受到EsrB调控的蛋白。其中,在DMEM培养条件下,共有7个蛋白的表达受到EsrB的激活,同时有12个蛋白的表达受到EsrB的抑制,而在LB培养条件下,则有5个蛋白的表达依赖于EsrB,同时EsrB阻遏了 4个蛋白的表达。这28个蛋白具有不同的功能,比如作为氧应激相关蛋白(SodB)和谷氨酰胺合成酶(GlnA)。后续的实验也证明,EsrB参与到EIB202中的活性氧(ROS)耐受以及谷氨酰胺合成相关途径。本论文构建了基于转座子插入位点高通量测序(Transposon insertion sequencing,TIS)的筛选技术和以DNA片段为诱饵的pull-down技术,用于EsrB上游调控因子的筛选。根据TIS的筛选结果,在EIB202中发现了 39个可能的EsrB上游调控因子,其中23个行使激活作用,16个为阻遏因子。TIS实验中发现,一种与环境压力应激密切相关的RNA聚合酶的σ亚基RpoS可以作为EsrB的阻遏因子。根据pull-down筛选结果发现,亮氨酰氨肽酶PepA可以直接结合在esrB基因的启动子区域。随后构建了 rpoS和pepA的突变株和过表达株,并通过qRT-PCR、胞外蛋白(ECPs)产生测定、转录融合荧光检测和自聚集实验等方法,证明RpoS和PepA确实在EsrB的表达过程中扮演了阻遏因子的作用,同时RpoS还介导了环境压力对EsrB表达的调控作用。本论文利用多组学结合的方法,对RpoS调控EsrB表达的分子机制进行了研究。通过DNase I footprinting和RNA-seq实验,找到了 RpoS结合在esrBB启动子上的基因序列,并通过点突变和体外转录方法,发现了 RpoS与RpoD在结合esrB启动子上的竞争性关系。利用点突变技术和分子模拟方法,找到了 RpoS阻遏esrB基因表达的关键碱基(-6G)和氨基酸位点(R99)。结合ChIP-seq和RNA-seq,利用统计学方法分析和确定了 RpoS阻遏基因表达的可能的普适性机制。更为重要的是,我们证明了 RpoS参与到自我保护和营养代谢能力(SPANC)的平衡微调机制假设,并发现了 RpoS介导环境对毒力系统调控的功能。本论文利用转座子插入突变体文库筛选方法对EIB202的铁摄取系统进行了全面的鉴定,发现EsrB受到铁摄取调控蛋白Fur的直接调控,同时EsrB也直接调控Fur蛋白以及铁摄取系统的表达。通过ChIP-seq实验,证明Fur通过EsrB对EIB202的T3SS/T6SS相关蛋白的表达进行调控并最终影响其毒力。另外,本论文利用EMSA、体外转录以及胞内cAMP检测方法,证明Fur通过直接调控Icc影响胞内cAMP水平,进而调控以cAMP为第二信使的各种信号通路和基因表达过程。总之,本论文既对EsrB在不同条件下对毒力和代谢相关途径的全局调控作用进行了研究,也较为系统地考察了调控该蛋白表达的上游调控因子和环境信号,为阐明该菌的毒力调控网络打下了良好的基础。