【摘 要】
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肿瘤抗原MAGE-A1(Melanoma Antigen,Family A,1)在多种肿瘤中都有表达,而在除睾丸之外的正常组织中不表达.因此,这种肿瘤特异性表达就使得MAGE-A1成为一个可以运用于肿瘤基因
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肿瘤抗原MAGE-A1(Melanoma Antigen,Family A,1)在多种肿瘤中都有表达,而在除睾丸之外的正常组织中不表达.因此,这种肿瘤特异性表达就使得MAGE-A1成为一个可以运用于肿瘤基因治疗的候选基因.在肝细胞肝癌中,MAGE-A1常过量表达,并在启动子区域呈低甲基化状态;为了解DNA甲基化介导的基因沉默机制,我们从如下几方面分析了细胞中基因启动子的功能:(1)应用半定量RT-PCR检测该基因在肝癌细胞株中的表达水平;(2)应用甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)检测该基因启动子区CpG岛在肝癌细胞株中的甲基化状态;(3)应用甲基化特异性PCR检测CpG岛中各个位点在BEL-7402和HepG2中的甲基化状态;(4)应用体外甲基化配合定点突变的方法,通过瞬时转染与荧光素酶报告基因检测,确定5个特殊CpG位点的关键性;(5)通过5-缺失突变与连接扫描突变的方法,通过瞬时转染与荧光素酶报告基因检测,进一步分析了与该基因表达调控有关的启动子的关键序列;(6)应用电泳迁移率改变实验(Electrophoresis Mobility Shift Assay,EMSA)寻找与-30位CpG位点附近序列结合的核蛋白.在对MAGE-A1基因的转录调控机制的研究中,我们发现:1.在所检测的4株肝癌细胞株中,MAGE-A1启动子的去甲基化状态与该基因在细胞中的表达相关,且该基因的转录受到DNA甲基化的调控;2.MAGE-A1启动子的-81和-30位CpG位点比较重要;3.最小启动子片段为-56~+263;4.一个新的序列特异性的DNA-蛋白结合在DNA甲基化介导的MAGE-A1基因转录沉默中起了重要作用,结合序列在-30位(相对于转录起始点).我们的结果不仅提供了DNA甲基化介导基因转录调控的新视角,因为它在肿瘤中去甲基化而在正常组织中高甲基化;而且为将来用MAGE-A1作为模型,描绘转录调控的表观遗传学机制铺平了道路,包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重构.
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