研究背景:脑卒中在当今社会是影响人类健康的主要疾病之一,具有较高的发病率、致残率和死亡率。缺血性卒中占脑卒中60%～70%,但是临床上仍缺乏有效治疗缺血性卒中的药物和有效的药物靶标分子。缺血后脑组织通常会受到损伤,从而影响机体其它正常功能的发挥。神经血管单元作为一个由神经元、胶质细胞、血管组成的复杂有机体单位,在脑卒中发生过程中每个组成单位都存在内在关联性并发生不同程度的反应。而基于神经血管单元深入发掘脑缺血损伤过程中的分子事件,以期发现病理过程中特异性强、敏感度高的药物靶标分子,为脑缺血保护及防治等课题的开展提供基础。脯氨酸异构酶(Peptidyl-prolylcis-trans isomerase)FKBP3(又名 FKBP25)是FK506-binding proteins(FKBPs)家族的成员之一,含有 peptidylprolylcis/trans isomerase(PPlase)的活性结构域。脯氨酸是组成人体蛋白质20种基本氨基酸中唯一的亚氨基酸,同时为蛋白质构象中顺反异构的转换提供了可能。目前已知的脯氨酸异构酶在多种组织中都有表达,参与多条信号通路,尤其是在蛋白质折叠、受体信号传递、蛋白质转运以及转录等方面发挥着至关重要的作用,但是有关FKBP25蛋白是否参与脑缺血引起的神经血管单元损伤过程及其调控规律和相关细胞信号转导机制仍不清楚。研究目的:本研究课题以神经血管单元中脑微血管内皮细胞和神经元为主要切入点,深入探索FKBP25在脑缺血中脑微血管应激损伤病理分子事件中的变化规律。一、阐明脑微血管缺血损伤进程中相关细胞应激信号激活传导对FKBP25稳态失衡的生物学变化规律及分子机制,考证脑血管内皮细胞脯氨酸异构酶FKBP25是以何种调控模式参与脑缺血损伤中脑血管的病理进程;二、考察FKBP25通过脯氨酸异构催化作用对脑内神经元发挥何种神经药理学效应。三、基于FKBP25酶活性结构域特点,设计特异性的脯氨酸异构酶荧光分子探针,为进一步解析FKBP25功能提供可视化检测技术。本研究将为探索脑缺血中药物作用的新型蛋白质靶标分子提供新思路,为治疗以脑缺血病变为基础的脑系疾病提供实验依据。研究方法和结果:本研究基于前期蛋白质组学质谱分析脑血管内皮细胞损伤前后的差异性表达蛋白群,结果显示FKBP25可能是调控脑血管内皮细胞缺血性损伤的重要蛋白之一。首先,通过蛋白质免疫印迹、免疫荧光、转盘式共聚焦显微镜等分子生物学手段和成像方法在细胞水平考察脑血管内皮细胞缺血损伤后FKBP25及其它相关应激蛋白表达的变化规律,结果表明FKBP25在脑血管内皮细胞缺血损伤早期阶段快速被激活,同时在缺血相关联的硝化应激的刺激下发生入核现象。利用免疫共沉淀、质谱鉴定、荧光共振能量转移(FRET)等技术手段,发现60S ribosomal protein L7(RPL7)是与FKBP25发生相互作用的候选蛋白之一。在细胞和动物水平分别对FKBP25过表达后,从细胞凋亡率、PARP蛋白降解程度、动物神经功能障碍评分、血管紧密连接蛋白完整性等方面进行评价,结果表明FKBP25能改善脑缺血引起的损伤发挥保护作用。第二,体外构建并纯化重组蛋白FKBP25,离体电生理记录发现FKBP25能有效减小锥体神经元钙电流,而脯氨酸异构酶抑制剂Rapamycin能抑制FKBP25酶活性从而减弱对钙电流的影响,通过使用离子通道特异性的激动剂和抑制剂,表明FKBP25可能参与调控L型钙离子通道的开放和关闭。第三,对脯氨酸异构酶新型检测荧光探针进行评价,通过酶动力学曲线记录和活细胞成像等技术手段,证实荧光探针可快速、高效、准确的对脯氨酸异构酶进行响应。结论:我们发现脯氨酸异构酶FKBP25参与血管内皮细胞缺血损伤应激反应,调控FKBP25蛋白表达能减轻脑缺血引起的神经血管单元损伤,进一步分子机制研究发现硝化应激及缺血损伤可诱发FKBP25发生浆核穿梭现象,并与RPL7蛋白相互作用而行使其功能。此外,神经元中FKBP25基于自身脯氨酸异构活性区域影响细胞钙电流,从而调节神经元的生理状态。同时,我们发展合成了能快速响应脯氨酸异构酶的可视化荧光探针(PPI-CT6),为在病理过程中监测该类酶活动提供新方法。