【研究背景】异位骨化(Heterotopic Ossification,HO)是指在正常骨骼系统之外(如:肌肉,跟腱等组织)的真正成骨。一般分为两类,第一类是创伤诱导的获得性的异位骨化。常发生于脊髓、神经损伤,大面积烧伤、烫伤,关节置换手术,矫形手术,战时创伤等。对于其发病机理,至今依然并不清楚。临床治疗措施相对单一,如手术切割,放射治疗,和非甾类抗炎药的使用,但是效果,预后都不甚好。当前遇到的最大的困难就是,即使使用物理化学手段将病变骨化区域摘除,只有一定缓解的作用,依然有大部分的患者会出现复发的现象。另外一种则是相对比较严重的,遗传性的异位骨化。常见有骨形态发生蛋白Ⅰ类受体ACVR1功能获得性突变导致的进行性骨化纤维发育不良(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva,FOP),以及编码Gα蛋白基因GNAS缺失突变引起的进行性骨发育异常(Progressive Osseous Heteroplasia,POH)。由于其一旦发病,难以逆转,所以当前对其研究较多。据报道,BMP-SMAD信号通路以及BMP-MAPK信号通路调控细胞向成骨分化进而调控异位骨化的进程。但是由于FOP病人一旦接受创伤诱导,将持续性异位成骨,最终失去生命,因而大多数研究都是停留在FOP病人的外周血,新生脱落的组织如乳牙等。总的来说,遗传性的异位骨化研究较为透彻,但是关于获得性的异位骨化,其发病原因多变,机理不明,发生率较高,社会影响较大,且治疗手段缺乏,所以获得性的异位骨化理应引起我们的重视。关于异位骨化的细胞起源,一直都有争议,有些学者认为是由内胚层的细胞,如内皮细胞,通过内皮细胞间质样转化成间质细胞参与异位骨的形成。甚至有人提到是由外胚层细胞发育而来。但是,主流的观点还是认为由中胚层的细胞,如间充质干细胞通过向软骨细胞,成骨细胞分化增殖来参与异位骨的形成。间充质干细胞,当前研究很热的一种成体干细胞,首次被发现于骨髓中一类区别与造血干细胞,但是有向软骨细胞,成骨细胞,成脂细胞的分化潜能,同时又是具有克隆形成能力的贴壁细胞。后来,又相继在胎盘,乳牙,骨,软骨,脂肪,骨骼肌,子宫内膜等组织中被发现。现在被广泛应用于再生医学,甚至是癌症治疗。其最大的特点就是具有较低的免疫原性和多向分化能力。经证实,间充质干细胞在体外可以分化为骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞,甚至是心肌细胞,神经元。正由于其与骨骼系统密切相关,并且分布区域符合异位骨化发生的条件,所以被认为是异位骨化真正的细胞来源,我们前期的研究也表明,Glast阳性的干细胞/前体细胞直接参与了异位骨化各个阶段的形成。并且这些Glast阳性的细胞表达间充质干细胞的相对特异的marker,这就在一定程度中佐证了间充质干细胞参与异位骨化的假设。另外,已有报道正式参与异位骨化形成的其他细胞亚群,如:Tie2~+,Mx1~+,Scx~+细胞,也都被证实很有可能是间质来源。最近,有学者证实胶质瘤相关癌基因同源基因1(Glioma-associated oncogene homolog 1,Gli1)蛋白是间充质干细胞的表面分子标志物(marker),而Gli1是Hedgehog(Hh)信号通路中一个至关重要的转录因子,并且,Hh信号通路参与调控正常骨的发育,尤其是软骨内骨化。所以这引起我们极大的兴趣去探究Hh信号通路在HO中到底扮演了什么角色。另外,CD133最近也被作为间质细胞的一个marker,尤其是造血干细胞和肌肉卫星细胞,值得一提的是肌肉卫星细胞,据报道也与异位骨化的形成有着密切的关系。所以本课题组提出假说,在具有FOP表型的Nse-Bmp4转基因鼠中,Gli1~+和CD133~+细胞是否都会直接参与异位骨化的进程,并进一步探究Gli1和CD133分别标记什么样的细胞。这不仅给异位骨化的发病机制研究甚至是治疗带来一线新的希望,另外对于间充质干细胞的在体研究也有着深远的意义。【研究方法】1.从国外引进Nse-BMP4小鼠模型,将其与Gli1-Cre ERT或者CD133-cre ERT小鼠进行交配,筛选出双阳性的子代小鼠(Gli1-cre ERT;Nse-Bmp4)或者(CD133-cre ERT;Nse-bmp4),进而与报告小鼠Zsgreen杂交,从而得到三重转基因小鼠模型(Gli1-cre;Nse-Bmp4;Zsgreen)。简单来说,Zsgreen报告小鼠,在cre重组酶的作用下,能够将Zsgreen前面的Stop基因盒子敲除,从而表达Zsgreen,发绿色荧光。所以在三重转基因小鼠模型中,我们可以直观地通过观察荧光来追踪Gli1或者CD133在异位骨化中的分布情况。2.成年三重转基因鼠(周龄大于一个月),按文献方法(1)腹腔注射他莫昔芬(Tamoxifen)溶液,然后通过向肌肉注射心脏毒素(cardiotoxin)损伤肌肉,在损伤后1周,2周,4周(分别对应着异位骨化早期,中期,后期)取相应时相的小鼠处死,并取其目的组织,即损伤的左后肢。将目的组织(即异位骨区域以及对照组未损伤部位)放入4%多聚甲醛中固定,过夜。第二天,放入20%EDTA溶液中进行脱钙一周,之后取组织进行冰冻切片,进行组织化学分析。3.免疫组化染色,确定Gli1-cre ERT或者CD133-cre ERT标记的细胞是否参与异位骨化的形成,另外通过与间充质干细胞的表面分子标志物,内皮细胞表面分子标志物,骨细胞表面分子标志物,软骨细胞表面分子标志物进行共染来验证其真实身份。首先取不同时相的切片,用胎牛血清封闭40min,加入一抗,过夜。第二天加二抗,核染色。用荧光显微镜观察各个蛋白在组织中的表达情况。【研究结果】1.Gli1或者CD133标记的祖细胞在小鼠体内皆有广泛表达,其中Gli1标记的细胞大多数分布在间质,且参与了正常长骨的形成;而CD133标记的细胞异质性比较大。2.Gli1标记的祖细胞在肌肉组织中包绕着血管,而CD133标记的细胞与血管关系并不紧密。3.Gli1标记的祖细胞参与了各个阶段异位骨化进程,而CD133标记的细胞在HO中几无贡献。4.干细胞微环境参与调控HO的进程。5.部分Gli1-cre ERT标记的祖细胞表达间充质干细胞的marker。Gli1-cre ERT标记的细胞在软骨形成期表达SOX9,在成骨阶段表达ALP,RUNX2。6.Bmp-smad信号通路介导了HO的形成。【结论】1.Gli1标记的间充质干细胞参与了异位骨化的形成,CD133~+细胞则相反。2.干细胞微环境参与调控HO的进程。3.Bmp-Smad信号通路参与了损伤诱导的HO的形成。