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中药炮制是我国独特的一门传统制药技术,大黄是临床“生熟异用”的典型。本论文紧紧围绕炮制改变大黄药性,即“生泻熟缓、生熟异治”,采用UHPLC-Q-TOFMS技术结合谱效关系,探讨生大黄炮制为熟大黄后的化学成分变化,确定与药效差异相关的有效成分；以大黄炮制前后“生泻熟缓”的功效变化为切入点,建立了符合中医“标本兼治”特色的“热结便秘”模型,以大承气汤为载体研究生、熟大黄对模型大鼠排便情况、胃肠激素和肠神经递质、水通道蛋白、H22荷瘤小鼠肿瘤生长等的影响,从方剂角度阐明了生、熟大黄“生泻熟缓、生熟异治”的合理性和正确性。目的本课题对生、熟大黄“生泻熟缓、生熟异治”的炮制机理进行研究,UHPLC-Q-TOF-MS技术与谱效关系相结合,确定能体现“生熟异治”功效变化的生、熟大黄的特征成分；建立“热结便秘”的动物模型对生、熟大黄“生泻熟缓”的功效进行验证评价,并按照中医标本兼治的用药原则,探讨“生泻熟缓”的炮制机理；通过探讨生、熟大黄对于HEPG2、MG-63、B16、HELA细胞体外的抗肿瘤活性和生、熟大黄对H22荷瘤小鼠的抑肿瘤作用及对免疫器官的影响,探讨“生熟异治”的炮制机理,为临床合理使用炮制品提供依据。方法采用文献学、药理学、化学相结合的手段,开展生、熟大黄“生泻熟缓、生泻熟补、生熟异治”的炮制机理研究。1、UHPLC-Q-TOF MS技术与谱效关系联用,指认生、熟大黄药效差异的标志性成分。2、采用药理学方法,建立能体现中医病证特点的热结便秘模型,探讨生、熟大黄单用和在复方中的作用差异。3、应用MTT比色法检测不同浓度生、熟大黄提取物(0、2.5、5、10、20、40、80μg/ml)对 HEPG2、MG-63、B16、HELA细胞增殖抑制作用,计算生、熟大黄及其乙醇提取物对细胞生长的抑制率。4、采用腹水型肝癌细胞株建立小鼠移植肿瘤模型,观察生、熟大黄对小鼠的一般状态,胸腺指数、脾脏指数、抑瘤率、小鼠的生命延长率的影响。5、以热结便秘模型为基础,从排便指数、胃肠激素、肠神经递质的变化等方面探讨生、熟大黄的作用差异。6、从水通道蛋白AQP2、AQP3、AQP4的基因表达变化结合“VIP-PKA-CAMP-AQP3"信号通路研究“生泻熟缓”炮制机制。7、本研究采用灰关联度分析将大黄“泻下”与“活血化瘀”作用的几个药效学指标：泻下指数、AQP3、ET-1等与所建立的特征图谱关联起来,找出特征图谱和药效指标之间的联系,建立谱-效关系,揭示大黄药效的变化与内在化学成分变化的相关性。结果1排便实验和泻下指数测定显示,对正常小鼠和热结便秘模型小鼠,生大黄与其复方大承气汤各剂量组EI明显增高,熟大黄及其复方大承气汤各剂量组EI变化不显著,生大黄泻下作用明显强于熟大黄(P<0.05),从单味药到复方都说明生泻熟缓。2 胃肠激素-神经递质-脑肠肽系统：生大黄组与熟大黄组比较,血清GAS、MTL、VIP、NT、SS、AchE、SP、ET-1的含量和结肠GAS、MTL、VIP、NT的含量均有统计学差异(P<0.01,P<0.05)。生大黄能够抑制结肠VIP的释放,升高血清MTL、NT、SS、SP、AchE及结肠MTL、NT的水平,增加结肠动力,促进排便。3胃肠激素-神经递质-脑肠肽系统：与大承气汤配伍生大黄组比较,大承气汤配伍熟大黄组GAS、MTL、VIP、NT、SS、AchE、SP、ET-1有统计学差异(P<0.01,P<0.05)。4对结肠水通道蛋白表达的影响：热结便秘模型大鼠结肠AQP2、AQP3、AQP4的表达增高；生、熟大黄治疗组、大承气汤配伍生大黄治疗组、大承汤配伍熟大黄治疗组均能使热结便秘大鼠结肠AQP2、AQP3、AQP4的表达降低：牛大黄治疗组与模型组比较有显著差异(P<0.05),熟大黄有降低趋势；大承气汤配伍生大黄治疗组与模型组比较有显著差异(P<0.05),大承汤配伍熟大黄治疗组有降低趋势。5 VIP-CAMP-PKA-AQP3通路：生大黄组较之模型组CAMP、PKA明显降低(P<0.05,P<0.01)；熟大黄组较之模型组PKA明显降低(P<0.01)；大承气汤配伍生大黄组与模型组比较CAMP、PKA明显降低(P<0.01)；大承气汤配伍熟大黄组与模型组比较PKA明显降低(P<0.01)。生大黄组与熟大黄组比较,大承气汤配伍生大黄组与大承气汤配伍熟大黄组比较CAMP和PKA均有统计学差异(P<0.05)。与模型组比较,生大黄组大鼠结肠组织AQP3表达量显著降低(P<0.05),其余各组大鼠结肠组织AQP3表达量有降低趋势。6 ENS-ICC-SMC:与模型组比较,阳性药组、大承气汤配伍生大黄组、大承气汤配伍熟大黄组大鼠结肠组织ICC含量极显著增多(P<0.01),生大黄组大鼠结肠组织ICC含量显著增多(P<0.05)；与ICC相关的兴奋性肠神经递质AchE、SP、NT与模型组比较显著增高(P<0.01),而抑制性肠神经递质VIP较之模型组,生大黄组和大承气汤配伍生大黄出现下降,后者有显著性差异(P<0.05)。7对HEPG2、MG-63、B16、HELA的抑制：生、熟大黄水提取物对于四种肿瘤细胞(HEPG2、MG-63、B16、HELA)均无抑制作用：生大黄乙醇提取物对于肝癌细胞HEPG2、宫颈癌细胞HELA有一定的抑制作用,对于MG-63、B16无抑制作用；熟大黄乙醇提取物对肝癌细胞HEPG2和宫颈癌细胞HELA的作用比较明显,当试药浓度为100μg/ml时,对肿瘤细胞的抑制率达到50%以上,而对MG-63、B16作用较弱或无抑制作用。大黄酸葡萄糖苷(RHG)对子宫颈癌细胞HELA增殖有一定的抑制作用,大黄素葡萄糖苷(EMG)和大黄素甲醚葡萄糖苷(PHG)几无作用；RHG对肝癌HEPG2增殖有较强的抑制作用,EMG有一定的抑制作用,PHG几无作用；RHG 和 EMG对骨肉瘤细胞MG-63有一定的抑制作用,PHG几无作用；对黑色素瘤细胞B16,三种化合物几无作用。8、H22荷瘤小鼠：小鼠的平均抑瘤率,与模型组比较,熟大黄高、中、低剂量组、生大黄高剂量组、替加氟组小鼠的平均瘤重具有显著差异(p<0.01,p<0.05)。生大黄中剂量组和低剂量组的平均瘤重与模型组比较无显著差异(p>0.05)。熟大黄高、中、低剂量组以及生大黄低剂量组的胸腺指数与模型组比较均有显著差异(p<0.01,p<0.05)。生大黄中、低剂量组、阳性药组与模型组比较无显著性差异(p>0.05)。模型组、阳性药组、生大黄高、中低剂量组的脾脏指数与空白组比较具有极显著差异(p<0.01),熟大黄高、中、低剂量组的脾脏指数与空白组比较无显著差异(p>0.05)小鼠生存时间,熟大黄高、中、低剂量组与模型组比较有极显著差异(p<0.01)。替加氟组及生大黄高、中、低剂量组小鼠生存时间与模型组比较无显著差异(p>0.05)；熟大黄各剂量组小鼠生存时间与替加氟组比较有显著差异(p<0.05),生大黄各组与熟大黄各组比较小鼠生存时间有显著差异。9、采用UHPLC/Q-TOF MS技术对生、熟大黄的化学成分进行了鉴定,本实验在大黄中检测到50余种成分,初步鉴定了46种成分,其中蒽醌类化合物28种,二苯乙烯苷类化合物3种,丁酮类1种,鞣质类化合物3种,黄酮类化合物2种,其他化合物9种。10、采用UHPLC/Q-TOF MS技术建立了生、熟大黄的特征图谱。11谱效关系研究结果：“泻下指数”关联度大于0.70的物质按关联系数从大到小的顺序：physcion-8-O-β-D-glucopyranoside>sennosideB>emodin-1-O-β-D-glucopyrano side>torachrysone-8-O-β-D-glucopyranoside>emodin>(-)epicatechin-3-O-gallate;“AQP3表达变化”关联度大于0.70的物质按关联系数从大到小gallicacid>aloe-emodin-3-CH2-O-β-D-glucopyranoside>Torachrysone>rhein>chrysophano 1>sucrose>physcion>catechin>aloe-emodin>gallic acid-4-O-β-D-glucopyranoside;ET-1关联度大于0.70的化学物质按关联系数从大到小排列的顺序为：physcion-8-O-β-D-glucopyranoside>emodin-1-O-β-D-glucopyranoside>sennoside B>torachrysone-8-O-β-D-glucopyranoside>emodin>(-)epicatechin-3-β-gallate。结论1采用病证结合模型对生、熟大黄的泻下作用差异进行了研究,表明：生大黄泻下指数(EI)高于熟大黄；生、熟大黄在复方中的配伍实验,发现大承气汤配伍生大黄的泻下作用明显强于大承气汤配伍熟大黄,从单味药到复方证明了大黄“生泻熟缓”炮制理论的正确性。2以胃肠激素-神经递质-脑肠肽,水通道蛋白表达,VIP-CAMP-PKA-AQP3通路,ENS-ICC-SMC为切入点对“生泻熟缓”炮制机制进行了研究,从多角度阐明了大黄的炮制机制。3从整体到组分的体内外抗肿瘤实验表明：熟大黄的抗肿瘤活性强于生大黄,从而证明了炮制确能增强大黄的活血化瘀作用。4谱效关系研究,找出了生、熟大黄药效差异与以下几个化合物密切相关：Physcion-8-O-β-D-glucopyranoside(大黄素甲醚-8-O-p-D-吡喃葡萄糖苷)Sennoside B(番泻苷B)Gallic acid(没食子酸)Catechin(儿茶素)Physcion(大黄素甲醚)创新点1采用病证结合模型,从单味药到复方,以复方为载体进行炮制机理研究,充分体现了中医“标本兼治”的用药特点。2采用多指标、多通路,研究大黄“生泻熟缓”炮制机理,进一步阐明了大黄“生泻熟缓”的科学内涵。3以从整体到组分的体内外抗肿瘤差异阐释大黄炮制后增强活血化瘀和补益作用,揭示了大黄“生熟异治”的功效差异。4谱效关系的研究,证明了炮制的物质基础与药效改变的相关性,为中药炮制原理的研究提供了一种新方法。