目的：　　非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）在细菌应对环境变化和致病过程中起重要作用。本课题组前期对伤寒沙门菌进行转录组测序分析发现了一系列的ncRNA，其中一个ncRNA，为bax的反义RNA，后被验证为malS基因的5非翻译区，因而命名为 malS-5UTR，其可能对于伤寒沙门菌在宿主胞内生存中发挥作用。因此，本论文将研究malS-5UTR调节伤寒沙门菌胞内生存力的作用机制，对于深刻理解ncRNA在伤寒沙门菌应对环境应激及致病过程中的调节作用有重要意义。　　方法：　　1. 制备ΔphoP-malS-5UTR菌株：提取重组质粒malS-5UTR-pBAD，制备ΔphoP菌株感受态，将提取的质粒电转至ΔphoP感受态。　　2. 巨噬细胞内生存实验：将 malS-5UTR 高表达菌株（WT-malS-5UTR）、空质粒对照株（WT-pBAD）和高表达malS-5UTR的 phoP缺陷株（ΔphoP-malS-5UTR）在LB培养基中培养至对数期，分别感染THP-1细胞，比较各个菌株在巨噬细胞内的生存力的差异。　　3. 细菌LPM条件下生长曲线的绘制：先将各菌株在LB培养基里培养至对数期，然后转接到 LPM 培养基中，以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标绘制曲线，观察各菌株在LPM培养条件下生长曲线的差异。　　4. 基因芯片分析malS-5UTR高表达菌株的转录组：将malS-5UTR高表达菌株和空质粒对照株在LPM培养基中培养12h，提取总RNA并逆转录成cDNA，同时用荧光素进行标记，再与基因芯片杂交，扫描后将荧光信号转换成数据，比较分析malS-5UTR高表达菌株和空质粒对照株的基因表达谱的差异。选择基因表达谱有差异的基因，用实时荧光定量 PCR 分析其在菌株间的表达差异，以验证基因芯片分析结果。　　5. 胞内ATP含量的测定：用ATP含量测定试剂盒检测各菌株胞内的ATP含量，比较各菌株胞内ATP含量的差异。　　6. WT-malS-5UTR、WT-pBAD与ΔphoP-malS-5UTR的MgtC::3×Flag标签融合菌株制备：采用自杀质粒pGMB151介导的同源片段重组方法，分别在伤寒沙门菌WT-malS-5UTR、WT-pBAD和ΔphoP-malS-5UTR的mgtC基因的终止密码子前插入 3×Flag 标签，制备融合菌株 WT-malS-5UTR-MgtC::3×Flag、WT-pBAD-MgtC::3×Flag和ΔphoP-malS-5UTR-MgtC::3×Flag。　　7. Western Blot 法检测细菌 MgtC 的表达量：在 LPM 培养基中培养WT-malS-5UTR-MgtC::3×Flag、WT-pBAD-MgtC::3×Flag、ΔphoP-malS-5UTR-MgtC::3×Flag融合菌株，收集全菌蛋白，以抗Flag单克隆抗体进行Western Blot免疫印迹分析WT-malS-5UTR、WT-pBAD和ΔphoP-malS-5UTR中MgtC蛋白表达的差异。　　8. malS-5′UTR 影响 S. Typhi 胞内生存力作用机制分析：用 qRT-PCR 检测WT-malS-5UTR、WT-pBAD 和ΔphoP-malS-5UTR 的 phoP、phoQ、mgtC、atp operon基因的表达水平，结合各菌株的ATP含量水平和在巨噬细胞内生存力的差异，分析malS-5′UTR对S. Typhi胞内生存力的作用机制。　　结果：　　1. 成功制备ΔphoP-malS-5UTR菌株。　　2. 巨噬细胞生存实验结果表明，malS-5UTR 能降低伤寒沙门菌在巨噬细胞内的生存能力；当phoP缺陷后，其在巨噬细胞内的生存能力更低。　　3. LPM 条件下生长曲线实验结果表明，malS-5UTR 能明显减慢伤寒沙门菌在LPM培养基中的生长；当phoP缺陷后，其在LPM中的生长更慢。　　4. 基因芯片结果表明，在malS-5UTR高表达菌株和空质粒对照株中，有147个基因的表达有显著差异。其中，与WT-pBAD相比，WT-malS-5UTR中atp操纵子的表达明显上调。　　5. 胞内ATP含量测定结果表明，malS-5UTR高表达通过上调atp操纵子的mRNA水平，从而增加了胞内ATP的含量；当phoP缺陷后，其胞内ATP的含量更高。　　6. 成功制备WT-malS-5UTR、WT-pBAD与ΔphoP-malS-5UTR的MgtC::3×Flag融合菌株。　　7. Western Blot检测表明，WT-malS-5UTR菌株中的MgtC蛋白的表达水平明显低于空质粒对照株；当phoP缺陷后，MgtC的表达水平更低。　　8. malS-5UTR通过下调phpP/phoQ的基因表达水平，减弱了mgtC的表达水平， mgtC 表达水平下降促使 atp 操纵子的表达水平增高，从而使 ATP 合酶（F1F0-ATPase）的活性增强，胞内的ATP水平增高导致伤寒沙门菌在巨噬细胞内的生存能力减弱。　　结论:　　malS-5UTR 能够以一种 phoP 依赖的方式下调 mgtC 的表达，从而减弱了mgtC 对 atp 操纵子的抑制作用，最终导致 atp 操纵子的 mRNA 水平增高。malS-5UTR高表达后，atp操纵子编码F1F0-ATPase的8个亚基表达水平增高，结果使胞内 ATP 含量的水平达到了非生理水平，从而导致了伤寒沙门菌在巨噬细胞内的生存能力下降。