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目的胶质瘤是颅内常见且危害性极大的恶性肿瘤,患者确诊后即使接受了积极的手术切除和放射、化学药物治疗后,胶质母细胞瘤患者的中位生存时间仍只有12-18个月[1],即使低级别的胶质瘤也没有完全治愈的。胶质瘤患者的不良预后是我们医学工作者面临的艰巨挑战,因此,深入研究胶质瘤的病因、发病机制、化疗耐药等问题具有重要的临床和社会价值。近年来,国内外学者成功地从胶质瘤细胞中分离获得胶质瘤干细胞[3,4-6],肿瘤干细胞被认为是肿瘤发生、发展与维持的基础,与肿瘤的复发、转移和对药物治疗的抵抗有关[7,8]。现有研究表明[9],从胶质瘤中分离出来的胶质瘤干细胞,其耐药性比较普通的胶质瘤细胞显著增强,胶质瘤化疗耐药的主要原因可能就在于胶质瘤干细胞可以产生强烈的化疗耐药性,导致患者对化疗药物抵抗并最终导致肿瘤复发[1 0]。因此,以胶质瘤细胞为载体模型揭示化疗耐药作用机制有局限性,以胶质瘤干细胞为模型的研究才有可能最终揭示胶质瘤发生和化疗耐药的机制,才有可能研制出对胶质瘤干细胞敏感性高的治疗药物,从而实现对胶质瘤的治疗[11]。内容本课题检测了U251细胞及其干细胞种植瘤抗凋亡基因Livin及多重耐药基因MRP1和MRP3的表达情况,分析了胶质瘤化疗耐药的可能原因。为此,我们培养U251细胞并从中分离CD133阳性胶质瘤干细胞,制作U251细胞及其干细胞裸鼠脑内种植瘤模型,研究替莫唑胺对U251细胞及其干细胞裸鼠脑内种植瘤抗凋亡基因Livin及多重耐药基因MRP1、MRP3表达的影响。方法1.应用免疫磁珠法从U251细胞中分选获取CDl33阳性胶质瘤干细胞。2.采取脑立体定向技术及微量进样技术构建U251细胞及其干细胞裸鼠脑内种植瘤模型。饲养荷瘤裸鼠12天后用不同浓度替莫唑胺连续干预6天,期间观察裸鼠的体重及生长行为学变化。3.处死荷瘤裸鼠,收集肿瘤标本,行石蜡包埋、HE染色及切片以及免疫组织化学染色,观察肿瘤的病理学特征。4.利用RT-PCR技术检测U251细胞及其干细胞种植瘤livin、MRP1和MRP3的表达。结果1.分选后的胶质瘤干细胞在无血清干细胞培养基中呈悬浮、球状生长,可以不断自我更新、复制,具有典型的“干细胞”特征。胶质瘤干细胞Nestin检测呈阳性表达,GFAP、β-tubulin检测为阴性。胶质瘤干细胞在含胎牛血清培养基中进行诱导分化,行GFAP、β-tubulin检测为阳性,Nestin检测为阴性。2.U251干细胞种植瘤组裸鼠较U251细胞种植瘤组裸鼠体重下降更快、皮肤颜色变暗更明显,表现出较强的恶病质。3.U251干细胞裸鼠脑内种植瘤与正常脑组织无明显分界。U251细胞裸鼠脑内种植瘤与正常脑组织有较为明显的分界。U251干细胞种植瘤GFAP的表达强于U251细胞种植瘤。4.U251干细胞种植瘤livin基因m RNA表达量显著高于U251细胞种植瘤,其差异有统计学意义(p<0.05)。U251干细胞种植瘤中多重耐药基因MRP1 m RNA表达量显著高于U251细胞种植瘤,其差异有统计学意义(p<0.01)。U251干细胞种植瘤中多重耐药基因MRP3 m RNA表达量显著低于U251细胞种植瘤,其差异有统计学意义(p<0.01)。化疗药物干预后,U251干细胞种植瘤多重耐药基因MRP1、MRP3m RNA表达量增高,其差异有统计学意义(p<0.01)。U251细胞种植瘤多重耐药基因MRP1 m RNA的表达量增高,而多重耐药基因MRP3 m RNA的表达量降低,其差异有统计学意义(p<0.01)。结论1.U251干细胞种植瘤模型裸鼠比较U251细胞种植瘤模型裸鼠体重下降更快,皮肤变薄,皮色变暗更明显,表现较强的恶病质,说明U251干细胞种植瘤较U251细胞种植瘤具有更强的生物学恶性。2.U251干细胞种植瘤与正常脑组织无明显分界,而U251细胞种植瘤与正常脑组织有较为明显的分界,说明U251干细胞种植瘤较U251细胞种植瘤具有更强的侵袭性。3.多重耐药基因MRP1和MRP3在U251细胞及其干细胞种植瘤的化疗耐药机制中发挥着不同的作用。多重耐药基因MRP1可能在U251细胞种植瘤化疗耐药中起着更为重要的作用。而U251干细胞种植瘤化疗耐药可能表现在多重耐药基因MRP1与MRP3的协同作用上。