研究背景:骨肉瘤是目前为止最常见的原发性恶性骨肿瘤,该肿瘤起源于间叶组织,发病率和死亡率均高于其他原发性骨肿瘤。其发病率约占人类恶性肿瘤的0.2%,发病年龄多集中在15～25周岁的青少年,男性患者较为多见,从发病部位来看,骨肉瘤通常发生在长骨的干骺端,依次最常见于股骨远端、胫骨近端、肱骨和腓骨近端,其次为股骨的近端、脊柱和骨盆等部位,致残率非常高。骨肉瘤也是青少年和儿童中最常见的原发性恶性肿瘤之一,约占所有儿科恶性肿瘤的2.4%。此外,骨肉瘤还具有高度的侵袭性和转移性。有统计表明,约有20%的患者在初次就诊的时候就已经出现肿瘤的肺部转移,另有约400%的患者在疾病晚期出现肺部转移。骨肉瘤病程进展快,转移早,复发率高,预后非常差,5年生存率非常低,单一手术患者5年生存率仅有15～20%。在治疗方法上,目前普遍采取外科保肢手术联合术后放化疗的综合疗法。在过去的几十年里,随着保肢手术技术的不断完善和新辅助化疗和放疗技术的不断改进,骨肿瘤患者的5年生存率显著提高了大约60～70%。但是骨肉瘤患者的远期预后仍然很差,约800%的患者在手术治疗后出现复发,较早肺转移和术后肿瘤复发等因素仍在困扰着骨科临床医生。目前报道的骨肉瘤复发患者的远期生存率不足20%。虽然目前市场上出现了几种分子靶向药物,但没有一种分子靶向药物能很好的用于骨肉瘤的治疗,化疗药物耐药性的出现及化疗药物的副作用(如肝肾毒性和心脏毒性等)大大限制了化疗药物的临床应用。可以说目前这些传统的治疗方法已经达到了瓶颈期。此外,骨肿瘤的早期诊断仍然十分困难。尽管病因不明,但越来越多的证据已经证明骨肉瘤的发生可能与参与DNA修复的基因缺陷和肿瘤抑制通路有关。因此从分子生物学角度探究骨肉瘤发生、转移和复发的机制,寻找新的骨肉瘤治疗靶点已经迫在眉睫。近期的很多研究证实microRNA在某些肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要的作用,这也为肿瘤的早期诊断和靶向治疗提供了新的思路。microRNA是一类内源性表达的小分子非编码RNA,其普遍存在于真核生物中,可以通过对靶向mRNA的裂解和/或翻译抑制来调控目标基因的表达,从而在细胞分化、增殖和凋亡的调控中的发挥着关键的作用。大部分microRNA的产生首先是由细胞核内的RNA聚合酶Ⅱ转录出具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的原始转录产物(pri-microRNA),pri-microRNA的长度从数百到数万个碱基不等。Pri-microRNA产生后,在核内被Ⅲ型核酸内切酶Drosha及辅助因子DGCR8催化加工,并在距离pri-microRNA茎环结构中单/双链结构分界点约11个碱基处被剪切,生成具有长度约为70～90个碱基的microRNA前体(pre-microRNA)。Pre-microRNA经核内的转运蛋白Exportin 5从细胞核转运至细胞质中,在另一种Ⅲ型核酸内切酶Dicer及其辅助因子TRBP的共同作用下剪切加工成约为22个碱基长度的microRNA双链,它的每一个单链都会形成一个成熟的microRNA。成熟的单链microRNA与Argonaute家族的多种蛋白质因子结合组装形成RISC复合体后,通过5’端被称为种子序列的碱基序列,与靶基因的3’ UTR互补配对,并在更多蛋白质因子的参与下调控基因的表达。由于microRNA具有高度的特异性、时序性和保守性,其被认为是一种新的相对特异的肿瘤标志物。然而,越来越多的证据表明,根据目标基因的不同,microRNA既可作为癌基因又可作为抑癌基因。microRNA的失调与许多恶性肿瘤的发生相关,如乳腺癌、肝细胞癌、肺癌、结肠癌,宫颈癌和骨肉瘤,因此microRNA被认为一种新的肿瘤标志物。自从1993年microRNA被首次报道以来,至今已经有超过1000种人类相关microRNA被发现。其中有很多种microRNA与骨肉瘤相关。相关报道中指出 MG-63 细胞中 microRNA-451、microRNA-1290、microRNA-765、microRNA-483-5p、microRNA-513a-5p、hsa-microRNA-129-5p 和hsa-microRNA-31 表达上调,microRNA-29b、microRNA-197、let-7b、microRNA-324-5p、let-7i和microRNA-484表达下调。通过阅读大量文献资料,我们发现microRNA-221在人类很多肿瘤组织中表达上调。更多的实验结果证实microRNA-221在人体内许多肿瘤细胞的分化、增值和凋亡中发挥着重要的作用。但是microRNA-221在骨肉瘤组织中的表达情况鲜有报道。本实验主要研究探讨microRNA-221在骨肉瘤患者组织中的表达情况及其与骨肉瘤多种指标的相关性和预后关系。研究目的:本文主要研究microRNA-221在骨肉瘤组织中的表达情况;探讨microRNA-221在骨肉瘤组织中的表达水平与肿瘤分期的关系;microRNA-221过表达与转移状态和化疗前反应的相关性;以及microRNA-221表达水平与临床病理类型、年龄、性别、部位之间的相关性;分析了高表达的microRNA-221水平与骨肉瘤患者预后的关系。为骨肉瘤的早期诊断和精准治疗提供实验依据。研究方法:(一)收集了 69例石蜡骨肉瘤标本及相应的非肿瘤癌旁组织。根据伦理和法律标准,所有标本保持匿名。所有的石蜡包埋组织需要经过两名以上的病理科医师确诊无误后才能继续实验。在随访期间,从诊断到死亡都进行了随访,并统计了总体生存率。还收集了所有患者的临床信息,包括年龄、性别、肿瘤发生部位、病理类型、对化疗的敏感性等。所有患者均可进行临床随访(中位数:19个月;范围:7～50个月)。随访结束时,37名患者仍然存活,32人死亡。总生存率计算从首次手术到死亡。所有死于其他疾病或意外事件的患者都被排除在本研究之外。(二)通过qRT-PCR检测骨肉瘤组织及相应的非癌组织中microRNA-221的表达。采用酸-酚-氯仿法从石蜡包埋样品中提取总RNA。按照供应商的指示,使用 TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA)和消化缓冲液(30 mmol/Ltris(hydroxy甲基)氨基甲烷-hcl[pH 7.5],20 mmol/L EDTA[pH=8]和 0.1%二乙基焦碳处理水中的1%十二烷基硫酸钠)提取总RNA。mi croRNA-221和RNU6B(作为内参)特异性 cDNA 是根据 TaqMan MicroRNA 检测方案(Applied Biosystems,USA),利用基因特异性引物从总RNA中获取的。用Taqman MicroRNA Assay(美国应用生物系统,美国)的qRT-PCR扩增和检测逆转录产物,特异性为hsamicroRNA-221。相对mRNA表达通过2-△△Ct方法使用应用生物系统公司7500实时PCR系统进行检测(美国应用生物系统公司)。以相对microRNA-221的中位值作为切入点,将69例骨肉瘤患者分为低表达和高表达两组。(三)对所有的临床数据资料使用SPSS18.0统计软件进行统计学分析,使用spearman相关性分析对microRNA-221与各临床病理指标进行相关性分析;使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线探究microRNA-221与肿瘤转移性、化疗效果和骨肉瘤患者预后的关系;使用Cox比例风险模型进行多因素生存分析。P<0.05认为有统计学意义。结果:在本研究中,我们发现了在石蜡包埋的骨肉瘤样本中,microRNA-221表达失调,并分析了其在潜在的临床相关生物标志物背景下的表达水平。采用qRT-PCR检测了 mi croRNA-221在骨肉瘤组织及邻近健康组织中的表达水平,结果发现,mi croRNA-221在骨肉瘤组织中比在健康组织中表达更高。接下来我们探究了 microRNA-221的表达与骨肉瘤各种临床病理特征之间的相关性。研究对象为中位年龄为21岁的骨肉瘤患者,共69例。结果发现,microRNA-221的表达随肿瘤分期的增加而增加;IIB/III期肿瘤的表达明显高于IIA期;microRNA-221的高表达与肿瘤转移状态、化疗反应显著相关。然而,microRNA-221表达水平与病理类型、年龄、性别以及肿瘤发生部位之间并无显著相关性。然后我们分析了microRNA-221的高表达与骨肉瘤患者预后的相关性。随访期间,分析了microRNA-221高表达和mi croRNA-221低表达骨肉瘤患者的临床资料。在本研究结束时,69名患者中有37名仍然存活,32名患者在研究期间死亡。Kap 1 an-Me i er曲线显示mi croRNA-221高表达的患者总体生存率低于microRNA-221低表达的患者。此外我们还发现,骨肉瘤患者的整体生存率也与肿瘤转移状态、化疗反应敏感性有关。最后,我们利用Cox回归分析,检测了对生存率具有显著独立影响的因素。单因素和多因素分析结果均证实,microRNA-221的表达、肿瘤转移和化疗敏感性是骨肉瘤的独立预后指标。结论:骨肉瘤的进展是一个复杂的过程,但microRNA-221可能在这个错综复杂的网络中发挥重要作用。综上所述,本研究发现microRNA-221在骨肉瘤样本中表达增加,microRNA-221过表达与临床分期和转移有关。此外,microRNA-221水平越高,预后越差。这些发现表明microRNA-221可能会成为一种骨肉瘤的新的诊断和预后标志物,或为骨肉瘤的治疗提供新的靶点。