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研究背景：乙肝病毒(HBV)感染是一个全球性的公共安全问题,慢性乙肝病毒感染导致严重的肝脏疾病,包括失代偿的肝硬化和肝癌等,严重威胁人类健康。我国处于乙肝病毒感染的高发区,因此阐明HBV的复制机制、发现清除病毒感染、控制疾病进程的潜在靶点是目前亟待解决的一个重要科学问题。CUL4B是CUL4B-RING-E3泛素连接酶复合体(CRL4B)的骨架蛋白,能够介导不同的底物蛋白泛素化修饰,参与调控多种生命活动过程,如：DNA复制和损伤修复,染色质重塑,细胞周期调控,胚胎发育,造血与生精等。本实验室的前期结果已证明,CUL4B能够促进HBV的复制,而对于乙肝病毒蛋白是否参与了CUL4B对HBV复制的调控以及确切机制仍不是很清楚。同时,肝脏作为乙肝病毒感染的主要靶器官,含有大量免疫细胞,因此也被认为是一个重要的免疫器官。在HBV感染的过程中,肝细胞本身除直接参与HBV复制过程外,尚可通过调控肝脏中多种免疫细胞的功能,影响机体清除病毒的免疫应答水平,与乙肝病毒感染的预后密切相关。因此本课题也对HBV感染模型中肝细胞CUL4B对局部免疫细胞功能的调节进行了初步探究。研究目的：1.研究HBV编码的病毒蛋白在CUL4B对HBV复制调控中的作用及机制。2.探索肝细胞CUL4B对肝脏免疫功能的调节作用。研究方法：1.肝细胞CUL4B调控HBV复制的机制研究1.1病毒蛋白Polymerase在CUL4B调控HBV复制中的作用1.1.1验证Polymerase蛋白在HBV复制中的作用构建Polymerase表达缺失质粒pcDNA3-HBV1.1 (ΔPol)。分别将pcDNA3-HBV1.1 (Polymerase蛋白野生型组)、pcDNA3-HBV1.1 (ΔPol) (Polymerase表达缺失组)、pcDNA3-HBV1.l(ΔPol)联合pcDNA3-Polymerase (Polymerase拯救组)转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA、收取培养上清ELISA检测HBsAg等病毒复制指标,验证Polymerase在HBV复制中的作用。1.1.2分析Polymerase在CUL4B调控对HBV复制中的作用将CUL4B过表达质粒或其对照质粒与pcDNA3-HBV1.1、pcDNA3-HBV1.1(Δ Pol)、pcDNA3-HBV1.1 (ΔPol)联合pcDNA-Polymerase共同转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA、收取培养上清ELISA检测HBsAg等病毒复制指标,分析Polymerase在CUL4B调控HBV复制中的作用。1.2病毒蛋白HBc在CUL4B调控HBV复制中的作用1.2.1验证HBc蛋白在HBV复制中的作用构建HBc表达缺失质粒pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBc),将pcDNA3-HBV1.1 (HBc蛋白野生型组)、pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBc) (HBc表达缺失组)、HBV1.1(ΔHBc)联合pcDNA3-HBc (HBc拯救组)共同转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA,收取培养上清ELISA检测HBsAg等病毒复制指标,验证HBc蛋白在HBV复制中的作用。1.2.2分析HBc蛋白在CUL4B调控HBV复制中的作用将CUL4B过表达质粒或对照质粒分别与pcDNA3-HBV1.1,pcDNA3-HBV1.1(Δ HBc)、pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBc)联合pcDNA3-HBc共同转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA,收取培养上清ELISA检测HBsAg等病毒复制指标,分析HBc蛋白在CUL4B调控HBV复制中的作用。1.3HB3x蛋白在CUL4B调控HBV复制的作用研究1.3.1分析HBx蛋白对CUL4B表达的影响首先,课题检测了HBx蛋白对CUL4B表达本身的影响。将HBV全基因组、HBx、HBc、preS2等不同片段的过表达质粒及对照质粒转染入HepG2田胞,提取RNA进行RT-PCR,检测CUL4B mRNA表达水平；提取细胞蛋白进行Western blot,检测CUL4B的蛋白表达水平,分析HBx蛋白对CUL4B表达的影响。1.3.2体外研究HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用将CUL4B siRNA及对照siRNA分别与pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx) (HBx蛋白表达缺失组)或pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx)联合pcDNA3-HBx (HBx拯救组)共同转染入HepG2细胞,提取细胞RNA进行RT-PCR,检测HBV pgRNA,收取培养上清ELISA检测HBsAg, HBeAg等病毒复制指标,分析HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用。1.3.3体内研究HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用选取周龄为6～8周龄、雄性肝脏特异性Cul4b基因敲除小鼠(C57BL/6品系,Alb-Cre+/-;Cul4bflox/y)及其相应野生型小鼠(Cul4bflox/y),尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1(ΔHBx)或pcDNA3-HBV1.1 (ΕHBx)联合pcDNA3-HBx,取外周血,用ELISA方法检测其血清HBsAg水平,采用real time-PCR方法检测血清HBV DNA水平,体内分析HBx在CUL4B调控HBV复制中的作用1.4 CUL4B对HBV cccDNA微染色质组蛋白修饰的影响已有文献显示,CUL4B通过调控组蛋白甲基化和泛素化修饰,进而调节宿主基因的表达,参与肿瘤发生。同时,有研究报道,HBV cccDNA通过与组蛋白结合,以微染色质的形式存在细胞核中,而组蛋白修饰状态与HBV复制水平密切相关。因此,本课题研究了CUL4B是否能与HBV cccDNA结合,以及是否能够影响HBV cccDNA微染色质组蛋白修饰状态?1.4.1 CUL4B与HBV cccDNA的结合状态采取文献中的方法,将prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HuH-7细胞,构建重组HBV cccDNA模型。提取HBV cccDNA,采用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法验证CUL4B是否能够与cccDNA相结合。1.4.2 CUL4B对HBV cccDNA微染色质中组蛋白修饰状态的影响将CUL4B siRNA或对照siRNA分别与prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HuH-7细胞,提取HBV cccDNA,采用ChIP-qPCR方法检测CUL4B表达对HBV cccDNA组蛋白乙酰化、甲基化修饰水平的影响。2.肝细胞CUL4B寸肝脏免疫微环境的影响2.1建立小鼠急性HBV感染模型选取周龄为6～8周的雄性肝脏特异性Cul4b基因敲除小鼠(C57BL/6品系,Alb-Cre;Cul4bflox/y)及其相应野生型小鼠(Cul4bflox/y),尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1全基因组表达质粒,构建HBV急性感染模型。pcDNA3质粒注射小鼠作为对照组。注射24h后收取外周血,realtime PCR检测血清HBV DNA的表达水平,比色法检测血清ALT水平。2.2肝细胞CUL4B表达对肝NK细胞和NKT细胞比例的影响取上述小鼠模型肝脏,研磨,用percoll法提取肝单个核细胞,流式细胞术检测NK细胞和NKT细胞在肝单个核细胞中所占的比例,统计在HBV急性感染模型及对照组中,肝细胞Cul4B敲除对肝NK细胞和NKT细胞的影响。2.3肝细胞CUL4B表达对肝脏NK细胞和NKT细胞IFN-γ分泌的影响取上述小鼠模型肝单个核细胞,胞内染色、流式细胞术检测NK细胞和NKT细胞IFN-γ的分泌情况。2.4肝细胞CUL4B表达对肝脏NK细胞表面活化受体表达的影响取上述小鼠模型肝单个核细胞,表面标记、流式细胞术检测NK细胞表面活化受体CD69、NKG2D的表达情况。研究结果1. CUL4B调控HBV复制的机制研究1.1病毒蛋白Polymerase不参与在CUL4B对HBV复制的调控作用1.1.1验证Polymerase蛋白在HBV复制中的作用成功构建了Polymerase蛋白表达缺失的HBV表达载体,并将其转染入HepG2细胞,检测HBV复制指标,结果显示Polymerase蛋白表达缺失可显著抑制HBV复制。1.1.2分析Polymerase在CUL4B调控对HBV复制中的作用将野生型或Polymerase蛋白表达缺失的HBV表达载体与CUL4B表达质粒共转染入HepG2细胞。结果显示,CUL4B过表达可显著提高野生型、Polymerase蛋白表达缺失型HBV病毒pgRNA水平和细胞培养上清中HBsAg水平,提示Polymerase并不参与CUL4B对HBV复制的调控过程。1.2病毒蛋白HBc不参与CUL4B对HBV复制的调控作用1.2.1验证HBc蛋白在HBV复制中的作用成功构建了HBc蛋白表达缺失的HBV表达载体,并将其转染入HepG2细胞,检测HBV复制指标,结果显示HBc蛋白表达缺失均可显著抑制HBV复制。1.2.2分析HBc蛋白在CUL4B调控HBV复制中的作用将野生型或HBc蛋白表达缺失的HBV表达载体与CUL4B表达质粒共转染入HepG2细胞。结果显示,CUL4B过表达可显著提高野生型、HBc蛋白表达缺失型HBV病毒pgRNA水平和细胞培养上清中HBsAg水平,提示HBc并不参与CUL4B对HBV复制的调控过程。1.3 HBx蛋白在CUL4B调控HBV复制的作用研究1.3.1 HBx蛋白上调肝细胞中CUL4B表达分别将HBV全基因组以及HBx、HBc、preS2等不同病毒蛋白过表达质粒或其对照质粒转染入HepG2细胞后,PCR及Western blot结果显示,HBx能够显著提高肝癌细胞中CUL4B mRNA和蛋白水平的表达。1.3.2体外实验证明HBx蛋白在CUL4B促进HBV复制中发挥重要作用将CUL4B siRNA及对照siRNA分别与pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx)质粒或pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx)联合pcDNA3-HBx质粒共同转染入HepG2细胞,PCR及ELISA结果显示,干扰CUL4B对于pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx)转染组pgRNA和HBsAg水平无显著影响,但却可显著抑制pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx)联合pcDNA3-HBx质粒共转染组中的pgRNA和HBsAg水平,提示HBx在CUL4B促进HBV复制中发挥重要作用。1.3.3体内实验进一步验证HBx参与CUL4B4进HBV复制的作用选取周龄为6～8周的雄性、肝脏特异性Cul4b基因敲除小鼠(C57BL/6品系,Alb-Cre;Cul4bflox/y)及其相应野生型小鼠(Cul4bflox/y),分别尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx)质粒和pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx)联合pcDNA3-HBx质粒,ELISA及real time-PCR分别检测血清中HBV DNA和HBsAg水平。结果显示,肝细胞Cul4b基因敲除对于pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx)注射组血清HBV DNA和HBsAg水平无明显影响,却可显著抑制pcDNA3-HBV1.1 (ΔHBx)联合pcDNA3-HBx注射后血清HBV DNA和HBsAg的水平,在体内进一步证实HBx参与了CUL4B促进HBV复制的过程。1.4 CUL4B可以影响HBV cccDNA为染色质组蛋白修饰1.4.1 CUL4B可以与HBV cccDNA相结合采取文献中的方法将prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HepG2或HuH-7细胞,构建重组cccDNA模型。染色质免疫共沉淀(ChIP)结果显示,CUL4B可以与HBV cccDNA相结合。1.4.2 CUL4B可提高HBV cccDNA结合的组蛋白H3乙酰化水平将CUL4B siRNA或对照siRNA分别与prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HepG2细胞或HuH-7细胞。ChIP-qPCR结果显示,在CUL4B干扰组细胞中,HBVcccDNA结合的组蛋白H3水平无显著变化,但结合的乙酰化,H3 (Ac-H3)水平显著下降,并且其中H3K27Ac水平的降低尤为明显。同时乙酰转移酶CBP、P300与cccDNA的结合也显著下降。以上结果初步提示,CUL4B可以提高HBV cccDNA结合的组蛋白H3乙酰化水平。1.4.3 CUL4B可影响HBV cccDNA结合的组蛋白甲基化水平将CUL4B siRNA及对照siRNA分别与prcccDNA和pCMV-Cre质粒共同转染HepG2细胞后。ChIP-qPCR结果显示,CUL4B干扰后,HBV cccDNA结合的H3K27Me3水平显著降低,而H3K4Me3水平有所升高。2.肝细胞CUL4B对肝脏免疫微环境的影响2.1应用Alb-Cre Cu14bfl0x/y肝特异性Cul4b基因敲除小鼠构建急性HBV感染模型采用周龄为6～8周的雄性肝特异性Cul4b基因敲除鼠及相应野生型小鼠,尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1全基因组表达质粒,构建急性HBV感染模型。pcDNA3质粒注射小鼠作为对照组。注射24h后收取外周血,realtime PCR检测血清HBV DNA的表达水平,证实急性肝炎模型构建成功。2.2肝细胞CUL4B对肝脏NK细胞和NKT细胞比例无明显影响取肝脏,研磨,用percoll法提取肝单个核细胞,进行流式细胞术检测NK细胞和NKT细胞在肝单个核中所占比例。结果显示,无论是pcDNA3注射组还是HBV质粒注射组,肝NK细胞和NKT细胞比例在肝特异性Cul4b基因敲除鼠及相应野生型小鼠无明显差异。2.3肝细胞CUL4B上调HBV感染模型中肝NK细胞IFN-γ的分泌流式细胞术检测上述小鼠模型中肝NK细胞和NKT细胞IFN-γ的情况。结果显示,pcDNA3或HBV质粒注射后,肝NKT细胞IFN-γ的产生在两组小鼠间无明显差异。而在HBV感染模型中,肝特异性敲除CUL4B能够导致小鼠肝脏内NK细胞IFN-γ的分泌显著高于野生型小鼠,但在pcDNA3注射组,两组小鼠NK细胞IFN-γ的分泌无显著性差异。2.4肝细胞CUL4B上调HBV感染模型中肝NK细胞活化受体表达流式细胞术检测肝NK细胞表面CD69、NKG2D受体的表达,结果发现,HBV质粒注射组中,肝特异性敲除Cul4b基因小鼠肝脏NK细胞活化性受体CD69和NKG2D表达比例的显著高于野生型小鼠,而pcDNA3注射小鼠,两组小鼠NK受体表达无明显差异。以上结果提示,肝细胞CUL4B可能通过调控肝脏免疫微环境进而调控HBV复制。研究结论与意义1.在前期工作的基础上,利用体内外实验进一步证实病毒蛋白HBx在CUL4B调控HBV复制中发挥重要作用,而polymerase口HBc蛋白未见明显作用。2.首次证实CUL4B可以结合HBV cccDNA,且可以通过影响结合的组蛋白甲基化/乙酰化水平调控HBV的复制3.首次发现肝细胞CUL4B可以调控肝脏NK细胞的活化和细胞因子分泌,进而影响HBV感染后的病毒清除机制。