马氏珠母贝磺基转移酶基因的克隆及功能分析

来源 :广东海洋大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:enjoy12_east
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磺基转移酶催化磺酸基团的转移过程对糖胺聚糖的合成起决定性作用,而糖胺聚糖因具有丰富的携带大量负电荷的磺酸基团,参与了生物矿化的成核过程。因此,本研究利用RACE技术获得马氏珠母贝磺基转移酶全长,研究其对糖胺聚糖生物合成的影响,深入探讨磺基转移酶及其参与合成的糖胺聚糖在贝壳珍珠质形成过程中的作用。实验结果如下:1.马氏珠母贝硫酸角质素磺基转移酶基因PmCHST1a(Pinctada fucata martensii Carbohydrate sulfotransferase 1a)和PmCHST1b(P.fucata martensii Carbohydrate sulfotransferase 1b)的克隆及分析。PmCHST1a全长1 385bp,编码366个氨基酸。含有磺基转移酶结构域(Sulfotransfer-3 domain),具有跨膜结构和信号肽,定位于高尔基体上。组织差异表达分析发现,PmCHST1a在马氏珠母贝中央膜和鳃中显著高表达(p<0.05)。RNA干扰后,PmCHST1a在中央膜的表达量显著下调(p<0.05);外套膜外液中糖胺聚糖的浓度显著降低(p<0.05);珍珠层结构排列不规则,珍珠板块边界模糊,板块之间连接紊乱。因此,PmCHST1a可能通过影响外套膜外液中糖胺聚糖含量的变化,影响珍珠层的形成。PmCHST1b全长1 342 bp,编码408个氨基酸,含有磺基转移酶结构域(Sulfotransfer-3 domain),无信号肽和跨膜结构,定位于细胞质。组织差异表达分析发现,PmCHST1b在中央膜、闭壳肌、肝胰腺和血细胞中均有表达。RNA干扰后PmCHST1b在外套膜中央膜的表达量显著下调(p<0.05);外套膜外液中糖胺聚糖浓度显著降低(p<0.05);贝壳内表面珍珠层发生变化,结晶表面有空洞,无明显结晶层结构,结晶板块形状不规则,边界模糊。因此,说明PmCHST1b可能通过影响外套膜外液中糖胺聚糖含量的变化,影响珍珠层的形成。2.马氏珠母贝硫酸软骨素磺基转移酶基因PmCHST11a(P.fucata martensii Carbohydrate sulfotransferase 11a)和PmCHST11b(P.fucata martensii Carbohydrate sulfotransferase 11b)的克隆及分析。PmCHST11a全长1 467 bp,编码438个氨基酸,含有磺基转移酶(Sulfotransfer-2 domain)结构域,具有跨膜结构和信号肽,定位于高尔基体上。组织差异表达分析发现,PmCHST11a在马氏珠母贝中央膜和鳃中高表达。RNA干扰后PmCHST11a在外套膜中央膜的表达量显著下调(p<0.05);外套膜外液中糖胺聚糖浓度显著降低(p<0.05);贝壳珍珠层表面粗糙,形状不规则,结晶板块边缘出现明显的C轴生长。说明PmCHST11a可能通过影响外套膜外液中糖胺聚糖含量的变化,参与珍珠层的形成。PmCHST11b全长1 540 bp,编码392个氨基酸,含有磺基转移酶(Sulfotransfer2 domain)结构域,具有跨膜结构和信号肽,定位于高尔基体上。组织表达差异分析发现,PmCHST11b在马氏珠母贝中央膜显著高表达(p<0.05)。RNA干扰后PmCHST11b在外套膜中央膜的表达量显著下调(p<0.05);外套膜外液中糖胺聚糖浓度显著降低(p<0.05);贝壳珍珠层表面凹凸不平,结晶板块边界模糊,表面粗糙。说明PmCHST11b可能通过影响外套膜外液中糖胺聚糖含量的变化,参与珍珠层的形成。3.马氏珠母贝磺基转移酶基因PmCHST9(P.fucata martensii Carbohydrate sulfotransferase 9)的克隆与组织分布分析。PmCHST9序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为1 074 bp,编码357个氨基酸;氨基酸序列分析得出PmCHST9具有典型的磺基转移酶结构域(Sulfotransfer-2 domain)和一个跨膜结构域;多序列比对结果显示PmCHST9与其它物种的CHST9同源性较低;荧光定量PCR检测结果表明PmCHST9在鳃中显著高表达(p<0.05)。因此推测PmCHST9可能参与马氏珠母贝的免疫调节。
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