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人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)的研究为细胞替代治疗开辟了新的途径,可是越来越多的证据表明不同hESCs系间在分化潜能等方面存在诸多差异,这使得hESCs在临床转化和疾病模型的研究上变得异常困难。视网膜色素上皮细胞(the retinal pigment epithelium, RPE)由视杯外侧细胞发育而来,位于脉胳膜和神经视网膜之间,由单层紧密相连的色素上皮细胞组成,对于维持光受体的正常功能起着重要作用。RPE的营养不良、病变和缺失会造成老年性黄斑变性(Age-related macular degeneration, AMD)和少年型黄斑营养不良(Stargardt’s macular dystrophy, SMD)等疾病。人们先后尝试了多种hESCs向RPE自发分化与诱导分化的方法,并通过实验证明了诱导分化来的RPE与内源性RPE在表达谱和吞噬等方面十分相似,但是现有方法分化效率较低,分化周期较长,远不足以满足临床移植的需求。近年来,许多研究报道了miRNA在诱导体细胞向iPS重编程中以及hESCs在向特定类型细胞分化中起着重要的作用。对hESCs系间的差异性、hESCs向RPE诱导分化以及miRNA在hESCs向RPE分化过程中作用的研究,将为干细胞疗法的临床转化奠定基础。本研究以H9和HSF1两个不同的hESCs系作为研究对象,比较了两个系之间向RPE诱导分化效率上的差异,并试图通过长期培养观察和对传代早期与晚期细胞中RPE65和CRALBP两个成熟标记的表达情况的分析寻找更多的差异。此外,我们还尝试使用RPE中特异性高表达的miRNAs对hESCs进行诱导分化,试图寻找到高效快速的诱导分化方法。研究结果小结如下：1、通过比较H9和HSFI向RPE诱导分化的效率,发现无论是使用Dkk-1和Lefty-A诱导分化方法,还是使用NIC诱导分化方法,H9和HSF1两个细胞系在色素团产生的效率上都存在显著差异,其中,HSF1比H9产生色素团的效率更高。2、经过7个月的连续传代培养,我们观察到H9可以很好地保持色素成分,而HSF1中色素逐渐变淡。对RPE成熟标记RPE65和CRALBP的Q-PCR检测分析发现,在两种不同的诱导分化方法中,CRALBP表达量都存在显著性差异,而RPE65的表达量则没有显著性差异。在培养至第9个月时,对CRALBP和RPE65的Q-PCR的检测结果显示,在两种不同的诱导分化方法中,RPE65在H9中的表达量相比在HSF1中都存在显著性差异。用NIC诱导分化的两个系中,CRALBP表达量上的差异消失,而用Dkk-1/Lefty-A诱导分化的两个系中,依然存在显著性差异。这提示我们在提高诱导分化效率的同时,还应考虑到不同诱导分化方法对细胞表达谱的影响,从而进一步优化诱导分化方法,以满足临床需求。3、对现有诱导分化方法进行了优化,一是在诱导分化前1个小时加入Y-27632处理细胞,防止在细胞团只有少数几个细胞时出现死亡的可能；二是在诱导分化前,把用于诱导分化的细胞铺在0.1%明胶包被的培养皿中以去除饲养层细胞；三是在用Dkk-1和Lefty-A诱导分化时,在第3天换液时直接换成只含10%KSR的培养基,利用低血清条件诱导细胞快速走向分化。结果表明,在matrigel上自发分化出色素团的时间为30天,比目前报道的6-8周有所提前。用Dkk-1和Lefty-A诱导分化出色素团的时间为27天,比目前报道的90天有明显提前。但用NIC诱导分化的方法也需要27天,与文献报道一致。4、对RPE的逆分化生长特性进行了研究。使用Dis/Col消化5分钟后,用玻璃针分离成100-200个细胞的团,在同一孔中接种较多的细胞团,可以一定程度上抑制逆分化的发生。RPE细胞不易贴壁,在用FBS替换KSR后,较易贴壁。为了改善贴壁效果,可用多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被培养板。5、尝试使用慢病毒在hESCs中过表达RPE特异性高表达的miR-204和miR-211,以期快速诱导其向RPE分化。此外,还尝试用此方法诱导逆分化的RPE向成熟RPE分化。总之,本研究为进一步阐明hESCs系间存在的差异提供了实验依据,加深了我们对RPE诱导分化和逆分化的认识,为本实验室进一步寻找系间差异的起因提供了良好的平台。此外,对miRNA在诱导hESCs向RPE分化过程中作用的研究为利用一种或少数几种因子在体外快速诱导产生特定类型细胞的方法提供了线索。