【目的】 本研究利用RNA干扰(RNAi)技术，以死亡相关蛋白激酶(DAPK)的mRNA 为靶点，构建一个使DAPK表达沉默的质粒，并将这些带有干扰序列的表达质粒转染PC12细胞，筛选稳定抑制DAPK表达的细胞株，同时观察这些细胞株的生长特性，为后续的实验研究提供基础。 【方法】 首先构建一株带有红色荧光蛋白和U6启动子的质粒载体。借助网络设计工具，从DAPK基因的开放读码框架中筛选了4个干扰位点，经过BLAST检查确定与其他基因没有同源性。人工合成上述4对正反义脱氧寡核苷酸链，经过退火形成dsDNA，定向克隆到构建好的质粒载体上，通过DNA测序鉴定重组结果。大量扩增重组质粒并用质粒提取试剂盒提纯质粒，利用脂质体将带有干扰序列的重组质粒转染至PC12细胞中，同时转染一株空载质粒作为空白对照。然后通过G418筛选细胞克隆，建立稳定增殖细胞株。再用Western blot检测转染细胞DAPK表达量的变化，用MTT法测转染细胞的生长曲线，用流式细胞术检测转染细胞生长周期变化。然后用NGF和乙醇协同诱导转染细胞向神经细胞分化，观察其形态特征。 【结果】 测序结果显示，U6 和四条干扰序列均已成功插入 pDsRed1-N1 质粒载体中，最终形成 pDsRed1-N1-U6-shRNAs 干扰质粒，分别命名为 F1、F2、F3、F4。在扩增和纯化后，各质粒经 Sofast基因转染试剂分别转染PC12细胞。G418筛选和荧光显微镜观察结果显示，各质粒均已成功转染进PC12细胞并长出细胞克隆。Western blot 结果显示，F2，F3，F4 干扰序列对DAPK的表达均有降低作用，其中以F2干扰序列的作用效果最为明显。令人意外的是，F1干扰序列使DAPK的表达明显增加。MTT结果显示，干扰序列对细胞株的生长增殖均具有促进作用，其中以转染F2干扰序列的细胞株增殖最为明显。同时，流式细胞术检测正常生长PC12细胞，对照组细胞和转染F2干扰序列细胞结果显示，转染F2干扰序列的细胞株 S 期的比例明显增加。NGF 和乙醇协同诱导细胞株向神经细胞分化，显微镜观察显示，到第七天时，各株细胞均已分化成较为成熟的神经细胞。 【结论】 成功构建带有红色荧光蛋白和U6启动子的质粒载体，同时将四条干扰序列顺利插入质粒载体中，然后成功转染到PC12细胞和筛选出单克隆细胞株。从实验结果来看，RNA干扰技术能有效降低DAPK的表达，对细胞的增殖有一定的促进作用。同时，CMV和U6两个启动子相安无事，并没有产生相互干扰作用。最后，NGF和乙醇能很好的协同诱导转染细胞向神经细胞分化，说明质粒转染对PC12细胞的诱导分化并没有实质影响。因此，应用siRNA表达载体法，建立稳定增殖和抑制DAPK表达的PC12细胞株是完全可行的。