转基因克隆技术是生命科学领域一项重大突破。目前，大多数研究是以体细胞核移植技术手段生产转基因动物。但是体细胞核移植的效率仍比较低，影响转基因克隆效率的因素有很多，并且都未研究透彻。胚胎冷冻保存是胚胎移植过程中重要的步骤之一，同时也是胚胎移植广泛推广应用的关键因素。冷冻优质胚胎可以加速良种家畜的繁殖速度，避免时间地域限制，可以进行世界范围内的应用。胚胎冷冻保存也可以解决随社会发展带来的生物物种资源急剧减少的问题，拯救濒危动物。本实验系统比较了程序化和玻璃化两种冷冻方法对转基因克隆牛胚胎的冷冻效果，比较了不同冷冻保护剂、不同时期的胚胎和不同承载载体对转基因克隆牛胚胎冷冻效果的影响。研究通过对冷冻复苏后胚胎的存活率、继续培养后孵化率、囊胚细胞数、细胞凋亡情况以及基因表达水平的检测来分析比较，从而选择出最适合冷冻转基因克隆牛胚胎的方法。为深入研究转基因克隆牛胚胎的冷冻保存提供技术依据，为提高转基因克隆动物生产效率打下基础。1、系统比较了程序化冷冻和玻璃化冷冻对转基因克隆牛胚胎冷冻效率的影响。实验结果显示：玻璃化冷冻复苏后的转基因克隆胚胎存活率显著高于程序化冷冻处理组（P<0.05），玻璃化冷冻解冻后胚胎经过继续培养第1—3天的孵化率也显著高于程序化冷冻组。进一步对囊胚细胞总数进行统计发现不同冷冻方法对囊胚细胞总数的影响差异不显著。但在囊胚细胞的凋亡率方面，程序化方法显著高于玻璃化处理组（P<0.05）。经过RT—PCR分析发现，玻璃化冷冻复苏后胚胎细胞的Bax基因的表达量明显低于程序化方法（P<0.05），而Oct4和Hsp70表达量则高于程序化处理组（P>0.05）。因此可知程序化冷冻和玻璃化冷冻都可支持转基因克隆胚胎的冷冻保存，但是玻璃化冷冻方法的效率显著高于程序化冷冻。2、对玻璃化冷冻转基因克隆胚胎过程中不同冷冻保护剂、不同时期胚胎和不同胚胎承载载体进行比较，进一步优化转基因克隆牛胚胎的玻璃化冷冻方法，提高转基因克隆牛胚胎的冷冻效率。实验结果显示：以乙二醇（EG）和二甲基亚砜（DMSO）混合作为冷冻保护剂进行冷冻，复苏后胚胎的存活率和第一天孵化率与乙二醇（EG）和二甲基亚砜（DMSO）单独处理组无显著差异，但混合处理组第二、三天的孵化率则显著高于EG和DMSO单独处理组。因此以EG和DMSO混合作为冷冻保护剂更有利于胚胎的后期发育。对2-细胞、8-细胞、桑葚胚、早期囊胚和囊胚时期的转基因克隆牛胚胎进行玻璃化冷冻，通过对解冻后胚胎存活率、孵化率、囊胚细胞数和凋亡率的综合比较，可知冷冻转基因克隆牛的早期囊胚效果最好。以不同的胚胎承载载体：玻璃细管、塑料细管和固体表面载杆对转基因克隆牛胚胎进行冷冻，结果显示以固体表面载杆为载体冷冻效果显著高于其他两组。因此，玻璃化冷冻以EG为冷冻保护剂，选择固体表面载杆为承载载体冷冻转基因克隆牛早期囊胚，可得到最佳效果。