论文部分内容阅读
目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,同时它也是女性癌症中死亡的主要的原因,且其发病的机制相对复杂,研究揭示乳腺癌的发病可能与个人生活的习惯、生活的环境、生殖方面的因素和遗传方面的因素等多种因素及其相互作用有关。随着对长链非编码RNA(long non-coding RNA,IncRNA)的研究的不断深入,lncRNA相关的生物学方面的功能也逐渐浮现,且重心已出现向单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)方面转移的倾向。有研究表明,前列腺癌相关转录本1(PCAT1)是多种癌症的致癌因子且与癌症的进展密切相关,如前列腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等,但PCAT1与乳腺癌易感性之间的研究尚未被发现。本研究的目的是探究PCAT1的8个SNPs与乳腺癌易感性之间的关联,并对乳腺癌相关的SNP进行初步的功能探究。方法1.生物信息学方法筛选PCAT1的SNPs并预测其潜在功能:综合使用NCBI、Ensembl、1000 Genomes和Haploview 4.2根据最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)大于0.05筛选位于PCAT1上的SNPs,然后通过lncRNASNP2、DIANA、OncomiR和RNAfold预测SNPs对PCAT1二级结构的影响及可能与SNPs相结合的miRNA。2.基因分型实验:本研究采用的是依据年龄进行频数匹配的病例对照研究,并使用PASS软件进行样本量计算,最终纳入研究的样本量为病例组504例,对照组505例。本研究对PCAT1的位点rs1551513,rs1551514,rs17762938,rs7823297和rs9656964采用SNPscanTM多重SNP分型试剂盒进行分型;位点rs117117537和rs785003使用imLDRTM多重SNP分型试剂盒进行基因的分型;位点rs4473999采用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction-restriction fragment-length polymorphism,PCR-RFLP)的分型方法进行基因的分型。3.实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR):本研究使用S YBR染料法进行qRT-PCR检测rs1 551514和rs4473999位点的不同基因型血浆中PCAT1的相对表达量。4.双荧光素酶报告基因实验:本研究通过构建野生型和突变型的质粒载体,采用双荧光素酶报告基因实验验证PCAT1 rs4473999基因型C/T对PCAT1与miR-149-5p的结合能力的影响。5.与PCAT1 rs4473999相结合的miRNA对乳腺癌细胞功能的影响:本研究通过构建miR-149-5p的敲低和过表达的慢病毒载体并在MDA-MB-231和MCF-7细胞中筛选稳转株,采用CCK8实验、划痕实验和Transwell实验分别检测miR-149-5p的异常表达对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。6.统计分析方法:本研究实验数据的统计分析所使用的软件主要包括SPSS 22.0,SHEsis在线分析软件、MDR软件和ImageJ等。研究对象的基本信息的描述和分析采用两独立样本的t检验或χ2检验;LncRNA PCAT1遗传变异SNPs与乳腺癌易感性之间的关联性分析使用非条件的logistic回归分析;拟合优度χ2检验被用来计算各个SNP在对照组是否符合Hardy-Weinberg平衡;多个SNPs之间的联合作用使用在线软件SHEsis分析;基因(SNPs)与生殖因素之间的交互作用采用多因子降维法(MDR软件)分析;qRT-PCR结果先根据2-ΔCt计算目的基因的相对表达量,最后用独立样本的t检验对组间进行差异性检验;双荧光素酶报告基因实验使用独立样本的t检验分析不同组间萤火虫荧光与海肾荧光比值的差异;CCK8实验采用独立样本的t检验分析不同组间OD值的差异;细胞划痕实验采用ImageJ计算划痕的面积,并计算划痕愈合率,然后用t检验分析不同组间细胞划痕愈合率的差别;细胞Transwell实验采用ImageJ对染色细胞计数,然后用t检验分析不同组间侵袭细胞数目的差异。结果1.PCAT1 rs4473999基因型CT在超显性模型中与乳腺癌风险增加相关(OR:1.343,95%CI:1.000-1.803)。分层分析的结果表明,rs4473999突变基因型CT+TT相对于纯合野生型CC在绝经年龄≥50岁(OR:2.137,95%CI:1.065-4.286)和流产次数<2(OR:1.510,95%CI:1.045-2.181)时均有较高的乳腺癌发病风险;rs785003突变基因型CT+TT相对于纯合野生型CC在无母乳喂养史时临界为乳腺癌的危险性因素(OR:2.764,95%CI:0.977-7.817),且其TT基因型与乳腺癌的HER-2激素受体状态存在关联(OR:0.158,95%CI:0.029-0.864);rs117117537突变基因型GT+GG相对于纯合野生型TT在绝经年龄≥50岁(OR:2.413,95%CI:1.057-5.508)时有较高的乳腺癌发病风险;rs1551514的突变基因型GA+AA与Luminal型乳腺癌之间存在关联(OR:0.671,95%CI:0.452-0.997)。2.PCAT1多个SNP联合作用的单倍型分析的结果提示单倍型Ars1551514Trs1551513Crs4473999Crs9656964Trs17762938Crs7823297Crs785003Trs1171 17537 在病例组和对照组中所占的频率最高,分别为33.7%和34.5%;单倍型Grs155 1514Trs1551513Crs4473999Crs9656964T5s17762938Crs7823297Trs785003Tr117117537可能增加乳腺癌的发病风险(OR:1.614,95%CI:1.116-2.333)。3.基因生殖因素交互作用结果表明PCAT1基因多态性rs4473999、怀孕次数和哺乳史之间存在交互作用,且携带rs4473999T基因型,怀孕次数≥2和有母乳喂养史的人群乳腺癌的发病风险是其对照组人群的2.487倍(OR:2.487,95%CI:1.929-3.206)。4.qRT-PCR的结果表明,对于rs1551514,PCAT1在基因型GG中的相对表达量高于GA(P=0.033)和AA(P=0.021)基因型;对于rs4473999,PCAT1在基因型CC中的相对表达量高于CT(P=0.001)和TT(P=0.038)基因型。5.双荧光素酶实验的结果显示,rs4473999携带野生型基因C时PCAT1与miR-149-5p之间存在相互作用,但当rs4473999携带突变型基因T时尚未观察到PCAT1与miR-149-5p之间存在相互作用。6.CCK8实验显示与阴性对照组(NC)相比较,miR-149-5p低表达组MDA-MB-231 细胞在450nm时24h(P=0.002),48h(P=0.002),72h(P=0.002)和96h(P<0.001)的OD值均较低;miR-149-5p高表达组MDA-MB-231细胞在450nm时24h(P=0.020),48h(P=0.016),72h(P=0.035)和96h(P=0.016)的OD值均较高。相似地,与NC组相比较,miR-149-5p低表达组MCF-7细胞在450nm时24h(P<0.001),48h(P=0.016),72h(P<0.001)和96h(P<0.001)的OD值均较低;miR-149-5p高表达组MCF-7细胞在450nm时24h(P=0.013),48h(P=0.014),72h(P<0.001)和96h(P=0.002)的OD值均较高。7.细胞划痕实验显示与NC组相比较,miR-149-5p低表达组MDA-MB-231细胞愈合率较低(P=0.023),miR-149-5p高表达组MDA-MB-231细胞愈合率较高(P=0.043);相似地,与NC组相比较,miR-149-5p低表达组MCF-7细胞愈合率较低(P=0.021),miR-149-5p高表达组MCF-7细胞愈合率较高(P=0.014)。8.Transwell实验显示miR-149-5p低表达组MDA-MB-231的侵袭细胞数目低于NC组(P<0.001),miR-149-5p高表达组MDA-MB-231的侵袭细胞数目高于NC组(P=0.014)。结论1.PCAT1位点rs4473999 CT基因型可能使乳腺癌的患病风险增加。位点rs785003纯合突变基因型TT可能与HER-2受体阳性性状相关;位点rs1551514的突变基因型GA+AA可能与Luminal型乳腺癌之间存在关联。2.Grs1551514Trs1551513Crs4473999Crs9656964Trs17762938Crs7823297Trs785003Trs117117537 单倍型可能增加乳腺癌的发病风险。PCAT1基因多态性rs4473999、怀孕次数和哺乳史之间存在交互作用,且可增加乳腺癌的患病风险。3.PCAT1 rs1551514位点G>A突变可能使PCAT1的二级结构发生变化,且不同基因型中血浆PCAT1的相对表达量不同。4.PCAT1 rs4473999 C/T突变可能影响PCAT1与miR-149-5p的结合能力且可能通过调控miR-149-5p的表达量影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。