肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC，以下简称肝癌)在全球恶性肿瘤发病率中占第6位，恶性肿瘤死因中占第3位。在中国恶性肿瘤死因中肝癌占第2位。肝癌复发转移是目前肝癌治疗失败的主要原因。手术切除是肝癌最有效的治疗方法，但是肝癌根治性切除术后5年复发转移率为61.5％，即使是小肝癌也达43.5％。肝癌复发转移是多基因、多因素参与的复杂过程。探索肝癌复发转移的分子机制，寻找有效的靶向治疗是进一步提高肝癌治疗效果的关键。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种分泌型糖蛋白，能促进细胞趋化，粘附和迁移。以往的研究发现OPN与肝癌侵袭转移相关。但是，OPN促进肝癌侵袭转移的分子机制及其在肝癌侵袭转移中高表达机制尚未阐明。第一部分骨桥蛋白在不同转移潜能肝癌细胞系及肝癌组织中表达情况研究不同转移潜能人肝癌细胞系及其肝癌组织中OPN表达情况，分析OPN表达与肝癌细胞侵袭转移潜能、肝癌术后复发转移的关系。应用细胞免疫组化、半定量RT-PCR、Western Blot和ELISA检测不同转移潜能人肝癌细胞系SMMC-7721、MHCC97-L和HCCLM6 OPN表达情况。应用组织芯片、免疫组化检测200例肝癌组织中OPN表达。结果发现OPN表达水平随着肝癌细胞侵袭转移潜能增加逐渐升高。肝癌组织中OPN表达与患者性别、年龄、血清AFP水平、肿瘤大小、有无包膜、细胞分化以及肝门淋巴结转移无明显相关性，而与肝癌TNM分期、门静脉癌栓和术后复发转移发生有明显相关(P＜0.05)。术后有复发转移患者的肝癌组织中66％表达OPN，而术后无复发转移患者的肝癌组织中仅37％表达OPN，两者比较差异具有显著性(P＜0.05)。肝癌组织中OPN表达是预测肝癌术后是否发生复发转移的指标。第二部分骨桥蛋白促进肝癌侵袭转移机制的初步研究研究OPN对肝癌恶性表型影响及其可能机制。用pcDNA 3.1(-)／OPN质粒转染低侵袭性无转移能力肝癌细胞系SMMC-7721细胞，以空质粒转染为对照，用半定量RT-PCR、ELISA和Western-blot检测转染后细胞OPN表达水平，体外功能试验观察细胞转染前后恶性表型的变化。用G418筛选获得稳定高表达OPNSMMC-7721细胞克隆，以空质粒转染为对照。用肿瘤转移相关的基因芯片比较两者基因表达的差异。real-time PCR、ELISA验证有差异表达的MMP-2、uPA基因。结果发现SMMC-7721细胞转染OPN质粒后，OPN表达水平明显升高。体外功能试验显示SMMC-7721细胞转染OPN质粒后，细胞粘附、运动和侵袭能力明显升高(转染后细胞粘附率75.33％±10.59％vs 57.34％±2.52％，运动试验穿膜细胞数14.33±2.51 vs 6.34±1.53，侵袭试验穿膜细胞数8.23±1.53 vs 4.124±1.29，P均＜0.05)，而转染后，细胞增殖能力的改变不明显。基因芯片比较发现稳定高表达OPN SMMC-7721细胞有88个肿瘤转移相关基因表达上调，有6个肿瘤转移相关基因表达下调。real-time PCR、ELISA发现高表达OPN SMMC-7721细胞MMP-2、uPA表达水平明显高于对照组(P均＜0.05)，而MMP-9表达水平没有明显变化，与基因芯片结果符合。OPN可能是通过增加MMP-2、uPA等基因的表达促进肝癌侵袭转移。第三部分高转移潜能肝癌细胞系HCCLM6细胞中骨桥蛋白高表达机制的初步研究探讨促进高转移潜能肝癌细胞系HCCLM6细胞OPN表达的相关机制。(1)提取基因组DNA，PCR扩增OPN启动子(-1488～+185)，应用转录因子芯片比较不同转移潜能、不同OPN表达水平的肝癌细胞系SMMC-7721细胞CCLM6细胞中结合OPN启动子的转录因子活性差异，筛选出与OPN转录有关的、有活性差异的转录因子。用凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)验证有活性差异的转录因子c-myb。real-time PCR检测不同转移潜能肝癌细胞系转录因子c-myb mRNA表达水平。用小RNA干扰(siRNA)抑制HCCLM6细胞c-myb表达后，观察其对OPN表达、细胞体外侵袭能力的影响。结果发现在SMMC-7721细胞和HCCLM6细胞中，调控OPN的转录因子活性存在显著差异，筛选出23个转录因子活性与OPN转录有关。EMSA、real-time FCR验证SMMC-7721细胞和HCCLM6细胞中转录因子c-myb活性、mRNA表达水平存在显著差异(P＜0.05)。c-myb特异性siRNA可显著下调HCCLM6细胞c-myb、OPN表达，明显抑制其体外侵袭能力。(2)运用生物信息学方法预测可能调控OPN翻译过程microRNA(miRNA)，real-time PCR检测不同转移潜能肝癌细胞miRNA-96转录水平，用miRNA-96抑制剂阻断或模拟剂增加HCCLM6细胞miRNA-96水平，观察其对OPN表达、细胞体外侵袭能力的影响。miRNA-96转录水平在SMMC-7721细胞和HCCLM6细胞之间存在显著差异(P＜0.05)。HCCLM6细胞miRNA-96转录水平升高与OPN表达增加有关。抑制HCCLM6细胞中miRNA-96水平可显著下调其OPN表达，抑制其体外侵袭能力。第四部分骨桥蛋白反义寡核苷酸靶向抑制肝癌侵袭转移的实验研究观察2’-O-(2-甲氧乙烷基)(2’-MOE)修饰的OPN反义寡核苷酸(ASOs)对高转移潜能肝癌细胞系HCCLM6侵袭转移的靶向干预作用，并探讨其可能分子机制。用脂质体转染ASOs干预HCCLM6细胞后，细胞免疫组化、半定量RT-PCR、Western Blot和ELISA方法检测细胞OPN表达的改变，以随机序列寡核苷酸(ASOs-C)和单用脂质体为对照组。MTT、流式细胞仪、Trans-well细胞运动、侵袭试验观察对细胞增殖、细胞凋亡、运动、侵袭能力的影响。ELISA方法测定ASOs处理后，HCCLM6细胞分泌MMP-2、uPA的变化。36只HCCLM6细胞肝脏原位接种裸鼠，随机、平均分成OPN ASOs治疗组、ASOs-C和生理盐水对照组。在原位接种肿瘤后第2天开始给药，腹腔注射(ip．)ASOs 50mg／kg，隔两天注射一次，连续给药12次。至第6周末，每组随机选6只裸鼠解剖观察肝癌生长、转移情况，免疫组化检测肝癌组织中OPN蛋白表达，肺组织切片H．E．染色观察肺转移情况。全血行血常规检查，血清行肝功能指标检查。每组剩余6只裸鼠观察生存时间。结果发现OPN ASOs能明显抑制HCCLM6细胞OPN表达，而ASOs-C和单用脂质体对OPN表达无抑制作用(P＜0.05)。400nM OPN ASOs处理HCCLM6细胞24h后，能明显抑制其体外运动、侵袭能力，而且MMP-2、uPA分泌水平明显降低，与ASOs-C和单用脂质体处理组相比差异有显著性(P＜0.05)。400nM OPN ASOs处理HCCLM6细胞24h后，对细胞增殖、凋亡无明显作用。裸鼠体内试验发现OPN ASOs治疗组肝癌肺转移发生率(2／6)明显低于ASOs-C和生理盐水对照组的肺转移发生率(均为6／6)，但是各组荷瘤裸鼠原位肿瘤的大小、生存时间没有明显差别(P均＞0.05)。ASOs对荷瘤裸鼠血细胞和肝功能没有明显影响。OPN ASOs能抑制高转移潜能肝癌细胞系HCCLM6细胞体内、外侵袭转移能力，是潜在的抗肝癌复发转移的靶向药物。结论1)OPN表达和肝癌细胞侵袭转移能力相关；肝癌组织中OPN表达与肝癌TNM分期、门静脉癌栓、术后复发转移发生有关。2)OPN促进低侵袭性肝癌细胞系SMMC-7721细胞的恶性表型，能引起多个肿瘤转移相关基因表达的改变。OPN通过增加MMP-2、uPA等基因的表达，促进肝癌恶性表型。3)高转移潜能肝癌细胞系HCCLM6细胞中，转录因子c-myb与OPN表达相关。miRNA-96转录水平与HCCLM6细胞OPN表达有关。c-myb表达水平、miRNA-96转录水平的增加，促进HCCLM6细胞OPN表达，两者可以作为调控OPN表达潜在的靶点。4)靶向OPN反义寡核苷酸能抑制高转移潜能肝癌细胞系HCCLM6细胞体内、外侵袭转移能力，是潜在抗肝癌复发转移的靶向药物。潜在临床应用价值1)OPN是抑制肝癌复发转移的潜在治疗靶点。2)c-myb、miRNA-96可以作为调控肝癌OPN表达的靶点。创新点1)发现OPN促进肝癌恶性表型中，MMP-2、uPA表达增加起重要作用。2)发现c-myb、miRNA-96水平增加可以促进肝癌细胞OPN表达。3)发现靶向OPN反义寡核苷酸可以抑制肝癌侵袭转移。