论文部分内容阅读
本论文一共可分为两部分:第一部分是关于miR-133b在前列腺癌中的作用及分子机制的研究。microRNA是一种细胞内源性的短链小RNA,它可以造成基因在翻译水平的抑制和mRNA水平的降解。在它的作用下,一些生物学过程中牵涉到的蛋白质分子可以维持在一个适当的水平。micro-133b (miR-133b)位于人类染色体6p12.2,目前很多研究报道了miR-133b在癌症中的作用,但它们的结果各不相同,有的研究报道它的促癌作用,有的报道它的抑癌作用。本实验室前期的基因芯片技术和生物信息学的研究表明,在雄激素诱导的条件下,miR-133b的表达量上调,其可能是受AR直接调控的靶基因。生物信息学的预测结果表明,pre-miR-133b转录起始点上下游10kb范围内有7个保守性较高的ARE元件。我们以前列腺癌细胞为模型,利用ChlP-PCR技术,发现了受雄激素激活的雄激素受体能够结合在miR-133b的7个预测的ARE元件上,并通过基因芯片和荧光定量RT-PCR实验证明AR能促进miR-133b的转录,从而从实验上证明miR-133b是受AR直接调控的靶基因。MTT实验表明,在雄激素刺激的条件下,过表达miR-133b显著促进了前列腺癌细胞LNCaP的增殖;并指出了miR-133b是前列腺癌基本的细胞生存和介导雄激素刺激的细胞活性所必需的。在此基础上,我们通过CCK-8和细胞周期实验,证实了miR-133b能够促进LNCaP和PC-3细胞的增殖以及细胞从G1-S期的转变,为有丝分裂做准备;通过检测细胞凋亡和胞内caspase活性,我们发现miR-133b能够抑制细胞凋亡和胞内caspase-3的活性,表示miR-133b是通过内源性凋亡途径抑制细胞凋亡的。通过表达谱芯片的数据分析和生物信息学预测,我们找到了miR-133b潜在的靶基因RB1CCl。通过luciferase活性实验,我们验证了miR-133b够直接结合到RB1CC1的3’UTR区域;通过real time RT-PCR和western blotting实验,我们确认了miR-133b对RB1CC1基因的负调控作用。我们在五个前列腺相关的细胞系中分别检测了miR-133b的本底表达和RB1CC1的蛋白水平,结果表明,在miR-133b的表达量与RB1CC1蛋白量之间存在负相关关系。RB1CC1基因在乳腺癌和其它一些癌症中已被报道为抑癌基因。通过细胞周期和细胞凋亡实验,我们发现了RB1CC1在LNCaP细胞中能引起G1-S期阻滞,并促进细胞凋亡,发挥了抑癌基因的作用。使用real time RT-PCR和western blotting方法,我们还进一步研究了miR-133b对RB1CC1下游通路的基因和细胞周期、凋亡通路中一些重要基因的调控,我们发现miR-133b抑制p53,RB1和caspase-3的表达,促进了p21的表达;在蛋白水平上,我们发现miR-133b抑制了RB1的蛋白活性,增加了p21的蛋白水平。前面的一系列细胞水平的实验表明miR-133b在前列腺癌中的原癌基因作用和RB1CC1的抑癌基因作用,miR-133b可以通过下调RB1CC1来部分发挥原癌基因的作用。至于miR-133b是否可以通过其他途径发挥其促癌作用则有待进一步的研究。为了在组织水平上验证我们前面得到的细胞学水平的实验结果,我们还收集了135例临床样本,制备组织芯片,结合免疫组化和原位杂交技术检测了前列腺癌根治术后患者的病理标本中AR蛋白、RB1CC1蛋白和miR-133b的表达水平及其相关性,并且探讨了这三个基因的表达是否可以独立预测前列腺癌根治术后的生化复发。我们发现miR-133b的表达和RB1CC1的蛋白水平都可以作为前列腺癌根治术后生化复发风险的独立的预测因素。AR阳性的前列腺癌比AR阴性的前列腺癌患者更易发生生化复发(p<0.05),miR-133b阳性的前列腺癌比miR-133b阴性的前列腺癌患者更易发生生化复发(p<0.05),RB1CC1阴性的前列腺癌患者比RB1CC1阳性的前列腺癌患者更易发生生化复发(p<0.05)。Pearson相关性检验表明,AR蛋白与miR-133b表达量之间呈显著的正相关(p<0.001),AR蛋白与RB1CC1蛋白量之间呈显著的负相关关系(p<0.001),miR-133b表达与RB1CC1蛋白量之间呈负相关趋势。这一结果与我们进行的细胞学水平的研究结果相互印证,进一步证明了AR-miR-133b-RB1CC1这一信号通路。这项研究不仅拓展了我们对前列腺癌miR-133b介导的雄激素受体通路的认识,而且为前列腺癌的诊断和治疗提供了新的线索和靶标。第二部分是关于SRD5A2基因三个多态性位点与前列腺癌易感性的meta分析。前列腺癌在过去的二十年中已经成为了一个公共安全问题。雄性激素被报道在雄激素信号通路中扮演着至关重要的角色,并能够开启或促进前列腺的癌变。因此,人们提出了一种假设:在雄激素生物合成和代谢通路中发生的基因突变可能是前列腺癌发生和发展的风险因素。人类体内有两种主要的雄性激素-睾酮和二氢睾酮(DHT)。类固醇5a还原酶能将睾酮还原成DHT。目前人们已经发现了两种类固醇5α还原酶,其中最主要的酶是类固醇5α还原酶α多肽2,由SRD2A2基因表达。经过此酶的催化后,DHT对雄激素受体的结合亲和力达到睾酮的5倍。我们使用meta分析方法研究了SRD5A2基因的三个多态性位点V89L、A49T和TA重复与前列腺癌患病风险的关系。我们发现,在世界范围内,89L对前列腺癌的易感性无显著影响,TA长重复多态性对前列腺癌的患病风险有一定的保护效应,49T显著增加了晚期前列腺癌(stage Ⅲ-Ⅳ)的患病风险。这一发现,拓展了我们对雄激素信号通路的基因网络的生物学功能的认识。