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MicroRNA(miRNA)是一类内源性、非编码、单链核糖核酸小分子,作为基因表达的关键性调控因子,在各种生理和病理过程中发挥着重要的作用。miRNA的异常表达,与各种疾病(如癌症、心脑血管疾病、糖尿病等)发生和进展过程中密切相关,被研究者视为一种极具潜力的生物标志物和基因治疗新靶点。但由于miRNA序列短、丰度低、家族同源性高、复杂的细胞内外环境及细胞表达异质性的特点,迫切需要发展高灵敏度、高选择性的miRNA原位检测体系。DNA链取代放大反应在miRNA胞内检测方面极具潜力。我们通过对链取代位置、链取代反应方式以及链取代的空间设计,构建了三种智能的miRNA原位检测探针,实现了细胞内肿瘤相关的miRNA高特异性、高灵敏的检测。具体工作如下:1.灵敏地区分细胞内前体和成熟体miRNA的丰度设计两对可编程的发夹寡核苷酸探针,通过特异性引发级联反应来区分细胞中的miRNA和pre-miRNA。发夹探针在没有靶标分子加入时,能以亚稳态共存。miRNA或pre-miRNA的引入后,分别触发特异性的杂交链式反应(HCR),形成DNA双链结构,并产生强烈的荧光信号。与传统的分子信标(MB)相比,该体系实现了在均质溶液中灵敏地评估miRNA和pre-miRNA,更重要的是可以避免由于miRNA序列同时存在于pre-miRNA中带来的假阳性信号。该体系实现了对不同细胞内miRNA及pre-miRNA的高灵敏、高特异性直接原位成像。2.DNA“纳米轮”探针通过局部DNA级联反应可视化细胞内miRNA设计一种DNA“纳米车轮”(DNW)探针,实现细胞内miRNA高灵敏的原位成像。在此体系中,6个经过修饰的DNA发夹探针与程序化设计的长链ssDNA杂交,靶标miRNA触发局域化的DNA级联反应(LDCR)沿着ssDNA发生,逐一打开淬灭的发夹探针,自组装形成六臂枝状的“纳米车轮”结构,并点亮三个荧光基团。在该体系中,miRNA作为催化剂,可产生多个发光的“纳米车轮”结构,即一个靶标miRNA可产生放大的荧光信号用于细胞内灵敏的成像。此探针的性能优于“一对一”的传统的分子信标(MB)和分子间杂交的六臂枝状的连接系统(SFHM),这归因于发夹探针高的局部浓度,赋予整个系统快速的反应动力学。这个程序化的DNW为快速高效的可视化活细胞中低丰度的miRNA提供了一种有价值的工具,这有助于了解miRNA的功能,探究其在生物医学中的应用。3.仿生的核酸框架灵敏快速捕获和检测活细胞中miRNAs受章鱼捕获食物时,触角间相互交换有价值信息的启示,我们提出了一种框架核酸(FNA)捕获技术,用于对活细胞中肿瘤相关的miRNAs生物标志物进行灵敏、快速和多重的成像。该系统由三个DNA三棱柱(DTP)组成,每个DTP分别携带两对亚稳态的催化发夹自组装(CHA)探针,AS1411适配体和悬挂在端部的、生物素修饰的DNA链,经过链霉亲和素进一步组装形成多价的DTP(SA-DTP)。SA-DTP系统就像章鱼一样,能够快速捕获目标癌症miRNAs,并优先在SA-DTP系统中的DTP的“触角”间传递,从而产生强的放大的荧光信号用于检测。实现对miRNA-155和miRNA-21在不同细胞中异常表达多重成像和表达变化的灵敏监控,显示了在疾病进展监测和疗效评估的可行性。