登革病毒属于黄病毒科黄病毒属,可分为1-4个血清型,可引起登革热(dengue fever, DF)、病死率很高的登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)以及登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS)。由于登革病毒各血清型间缺乏有效交叉保护,并存在抗体依赖的感染增强作用,迄今为止仍缺乏安全有效的疫苗。登革病毒基因组长约11kb,共编码3个结构蛋白(C、prM/M和E)。E蛋白是主要的包膜糖蛋白,位于病毒颗粒的脂质双层中,构成病毒颗粒表面的突起,含有多种B细胞和T细胞抗原表位,是登革病毒的主要保护性抗原。PrM蛋白是膜蛋白M的前体,除具有抗原功能区外,还有助于E蛋白的正确折叠及其稳定,而且prM和E双基因的联合表达可形成病毒样颗粒(VLP)。因此,prM蛋白和E蛋白成为研究登革病毒疫苗的重要靶标。近年来在广州地区登革病毒1型流行规模最大的是GZ01/95株,经过进化分析其CDS区发现该毒株一直在东南亚、大洋洲、印度洋和南非地区流行,在登革病毒1型中有着重要的代表意文。本研究选择登革1型病毒GZ01/95株,利用哺乳动物表达系统和杆状病毒-昆虫细胞表达系统分别表达其prM/E蛋白,通过基因修饰和改造,研究其在真核细胞中分泌表达情况,为深入研究prM/E蛋白的免疫学功能和特性创造条件。本研究主要分为两部分：一.登革病毒prM/E蛋白在哺乳动物细胞中的分泌表达研究提取病毒RNA,利用RT-PCR法获得登革病毒1型GZ01/95全长prM/E基因,同时通过基因合成和融合PCR的方法在prM基因前添加乙型脑炎病毒的信号肽序列或同时替换E基因羧基末端的20%为乙脑病毒E基因相应的部分,获得JSSprME基因和JSSprM80E20JE基因,分别将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT中,经过酶切鉴定和测序鉴定后获得三种读码框架及序列正确的重组质粒D1prME-pcDNA5/FRT, D1JSSprME-pcDNA5/FRT,D1JSSprM80E20JE-pcDNA5/FRT。用脂质体法分别将重组质粒DNA转入293T细胞进行瞬时表达,通过免疫荧光法检测到分别转染了三种重组质粒的293T细胞的胞浆中均有登革1型病毒蛋白的表达。Western印迹检测结果显示转染了D1prME-pcDNA5/FRT重组质粒的293T细胞上清中没有特异蛋白条带,转染了经基因改造的重组质粒D1JSSprME-pcDNA5/FRT和D1JSSprM80E20JE-pcDNA5/FRT的细胞上清中均存在登革1型病毒的特异蛋白条带。故转染了三种重组质粒的293T细胞均可表达登革1型病毒prM/E蛋白,只有在prM基因前添加了信号肽的重组质粒转染后蛋白才获得分泌表达。二.登革病毒prM/E蛋白在杆状病毒-昆虫细胞中的分泌表达研究提取病毒RNA,利用RT-PCR法获得登革病毒1型GZO1/95株的D1C42prM/E基因,同时通过PCR扩增DIJSSprME基因和D1prME基因,分别将其克隆入杆状病毒表达载体pAcUW51-M, pAcGP67-B, pAcSecG2T中,经过酶切鉴定和测序鉴定后获得四种读码框架及序列正确的重组质粒D1C42prME-W51,D1JSSprME-W51, D1prME-67B, D1prME-G2T。用BD BaculoGold共转染试剂盒将此四种重组质粒及已建好的重组质粒D1prME-W51分别与杆状病毒线性化DNA共转染SF9细胞,经过空斑纯化后扩增高滴度的病毒毒种,感染SF9细胞,通过免疫荧光法检测到分别转染了五种重组质粒的sf9细胞的胞浆中均有登革1型病毒prME蛋白的表达。SDS-PAGE及Western blot结果进一步显示转染细胞中存在登革病毒蛋白的表达,Western blot结果显示添加乙脑信号肽的重组质粒D1JSSprME-W51转染后表达上清浓缩30倍后可见较弱目的蛋白条带,而其他转染质粒转染后表达上清中未见目的蛋白条带,经过基因修饰改造后,外源蛋白在sf9细胞中的未获得分泌或分泌表达量较低。综上所述,本研究运用真核表达系统,通过对登革病毒prME基因的修饰改造,在哺乳动物细胞中获得prME蛋白的分泌表达,这为研究其它型别登革病毒prME蛋白分泌表达时表达系统的选择及表达条件的优化提供了理论依据,为深入研究prM/E蛋白的免疫学功能和特性创造条件,同时为多价病毒样颗粒疫苗的研究奠定了基础。