抗GPC3×CD3双特异性抗体的构建及其抗肝癌活性研究

来源 :厦门大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wanghai19881016
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肝细胞癌(HCC)是危害人类健康的常见恶性肿瘤,仅在我国肝癌的死亡率就占到了 55%左右。有研究表明,磷脂酰肌醇蛋白-3(GPC3)在一些恶性肿瘤中高度表达,其中在肝细胞癌中的阳性率在60%以上,并且在正常肝组织以及非肝癌组织中不表达。因此,GPC3在临床的诊断和治疗上是一个很有潜力的靶点。GC33是一株特异性靶向GPC3的高亲和力人源化抗体,可通过ADCC功能杀伤GPC3阳性的肝癌细胞,临床Ⅰ期试验证明了 GC33的安全性,但其在临床Ⅱ期的试验中结果却不尽人意,与对照组相比GC33未能延长患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。双特异性抗体能通过CD3靶标招募T细胞到肿瘤部位,特异性的杀伤肿瘤细胞,Fc功能区的保留能够刺激肿瘤微环境的免疫细胞发挥自身抗肿瘤效应。本研究通过基因工程的方法构建了两种不同形式的抗GPC3×CD3双特异性抗体,一种是将单链抗体加在天然抗体轻链的C末端,而另一种则是将天然抗体的可变区替换为单链抗体,并用CHO细胞进行瞬时转染表达,结果发现单链抗体连接在C末端的设计具有更高的抗体表达水平,产量为13mg/L,约是另一种设计抗体表达量的40倍;此外,靶向不同靶标的单链抗体连接在抗体轻链的C末端对于抗体的结合活性有较大的影响,将GC33单链抗体连接在CD3抗体轻链的C末端能够较好的保留针对GPC3和CD3的结合活性,且与亲本抗体的结合活性相当;而CD3单链抗体连接在GC33抗体的轻链C末端则大幅度降低了与CD3靶标的结合活性。最终,CD3K-SCFV-GC33这株双特异性抗体能较好的结合GPC3和CD3靶标,并具有很高的表达水平,通过SDS-PAGE和HPLC分析其纯度也在95%以上。通过对CD3K-SCFV-GC33进行体外的生物活性验证,该双特异性抗体能高效刺激T细胞的激活,并产生较高水平的IL-2和IFN-y,这些细胞因子可以诱导T细胞之外的免疫细胞激活并发挥抗肿瘤功能;在体外细胞杀伤实验中,与GC33相比,CD3K-SCFV-GC33能够在24h快速杀伤肝癌细胞,并在48h的杀伤率为60%以上,约是GC33杀伤率的3倍。在NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型中,活体荧光成像显示CD3K-SCFV-GC33和GC33都具有较好的体内靶向功能,但CD3K-SCFV-GC33表现出更为稳定的体内靶向功能,荧光强度72小时后几乎未出现衰减,并且CD3K-SCFV-GC33抑制肿瘤的生长的效果与GC33相当。因此,本研究成功构建了一株表达量和纯度都较高的抗GPC3×CD3双特异性抗体,并验证了其在体外和体内都具有较好的抗肿瘤功能,为双特异性抗体的设计提供参考方案,也为肝癌的晚期治疗药物的开发提供一种新的手段。
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