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尼帕病毒(Nipah virus,NiV)最初于1998年在马来西亚暴发,引起人类致死性脑炎和严重的呼吸系统疾病。NiV因致病性强、宿主范围广及大流行的潜在威胁等特点,成为人们关注的公共卫生问题。截至2018年6月,NiV已造成643名实验室确诊病例,导致至少380人死亡。目前尚无有效的抗NiV药物和疫苗,为防范NiV疫情在我国发生和流行,建立NiV的检测方法尤为必要。研究方法:本研究基于NiV N基因保守区设计引物和探针,建立逆转录实时荧光定量PCR检测方法,并对检测方法进行评价和应用;针对在NiV侵入宿主细胞发挥关键作用的F和G蛋白,利用真核表达载体构建NiV假病毒,对NiV假病毒进行鉴定,并应用于血清中和抗体检测及效价评定;利用昆虫杆状病毒表达系统表达NiV N蛋白,对重组蛋白进行鉴定,为进一步筛选单克隆抗体,建立NiV抗原检测方法奠定基础。研究结果:一、尼帕病毒Taqman qRT-PCR检测方法的建立及应用1.建立NiVTaqmanqRT-PCR检测方法,引物和探针具有良好的特异性,检测下限为102 copies/μL,标准曲线线性范围为 1.0×109～1.0×102 copies/μL;标准曲线 R2=0.995,线性关系较好;重复试验变异系数小于5%,稳定性和重复性较好。2.本检测方法可有效检出NiV马来西亚株和孟加拉株,利用本方法检测83份蝙蝠肺组织和脑组织匀浆样本核酸,检测结果均为阴性。二、尼帕病毒假病毒的制备及血清中和抗体检测方法的建立和评价1.优化并合成 NiV F 和 G 基因,利用真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro表达NiV膜蛋白F和G,借助人类免疫缺陷病毒载体pNL4-3.Luc.R-E-在293T细胞中成功包装出NiV假病毒,并对包装条件进行优化。对包装的NiV假病毒进行鉴定,Western Blot证实细胞裂解液中存在F和G蛋白,透射电镜下观察到NiV假病毒颗粒,为直径约为100～200nm的圆形或椭圆形的颗粒,颗粒内部为致密的电子核心,周围附有包膜,膜上有刺突。2.利用原核表达载体pET30a表达NiV F和G蛋白,采用Ni2+亲和层析纯化NiV F和G蛋白。F和G蛋白分别皮下免疫家兔获得免疫血清,间接ELISA法检测两种蛋白兔血清抗体滴度均达到1:40960。3.血清中和实验表明NiV假病毒与F和G蛋白家兔血清均发生中和作用,证明本研究构建的NiV假病毒可以应用于血清抗体中和实验检测及效价评定。三、尼帕病毒核蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定1.利用杆状病毒表达系统(pFastBacHTA载体)和Ni2+亲和层析技术表达及纯化NiV N蛋白,经SDS-PAGE检测,重组蛋白rBac-N纯度达到90%以上。2.对重组杆状病毒rBac-N进行鉴定,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可见特异性目的条带。研究结论:1.建立尼帕病毒TaqmanqRT-PCR检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可用于NiV的核酸检测。2.成功包装NiV假病毒,家兔血清抗体中和实验证明该假病毒可用于血清中和抗体检测。3.表达和纯化NiV N蛋白,为制备抗体及建立针对NiV抗原的血清学检测方法奠定基础。