每年全世界有成千上万的婴幼儿接受外科手术、有创性治疗或一些需要麻醉辅助的影像学检查,这些婴幼儿需要接受各种麻醉药和镇静药的辅助治疗,因此,研究麻醉药对发育中大脑的影响具有重要的临床意义。研究显示临床上使用麻醉药对发育中的哺乳动物大脑有潜在危害,在大脑快速发育期,也就是突触形成期,给予麻醉药会引起哺乳动物大脑敏感区域神经凋亡,尤其是在出生后第七天鼠,对麻醉药的凋亡作用非常敏感。越来越多数据表明麻醉药包括异氟醚、氯胺酮、NO、咪唑安定、硫喷妥纳、异丙酚、七氟醚对发育中大脑有毒性作用并且能引起长时期认知功能障碍。神经毒性的严重程度与剂量和暴露的时间有关,并且复合麻醉后加重,其机制涉及GABA、甘氨酸、谷氨酸、尼古丁等多个受体和相关的通路,但是其具体的分子机制并未明确。　　 异丙酚(Propofol)是一种新型的短效静脉麻醉药物,80年代中期开始应用于临床。1989年美国FDA通过并推荐临床使用,目前被国内外广泛应用于临床麻醉诱导、维持及ICU镇静。随着临床的广泛应用,人们发现异丙酚有其独特的优点:起效快,麻醉状态可控性强,维持时间短,苏醒迅速,无积蓄,副作用小等,在产科和儿科手术也逐渐被推广使用,目前临床上输注异丙酚是否会导致学习、记忆障碍或者发育延迟还没有报道,但已经有动物研究表明异丙酚对发育中大脑神经有促凋亡作用,长时间使用异丙酚会导致神经细胞凋亡数明显增加,并且成年后学习能力缺失,然而异丙酚引起神经凋亡与神经功能损害的机制目前还不清楚。　　 为了探索异丙酚引起细胞凋亡的机制,有学者研究了异丙酚及GABA-A调节剂对细胞内钙离子及海马神经细胞早期及延迟细胞死亡的影响。研究发现体外培养出生后第四天海马神经细胞暴露于5umol/L异丙酚5个小时引起细胞去极化,细胞内钙离子浓度升高,Caspase激活,促进细胞死亡,使用GABA-A受体阻断剂荷包牡丹碱或者钙通道阻断剂引起细胞内钙离子浓度降低,抑制细胞死亡,细胞内钙离子浓度升高是细胞凋亡的必要条件,但使用GABA-A激动剂蝇蕈醇虽然引起细胞内钙离子浓度升高,但没有出现细胞死亡,因此钙离子浓度升高不能完全解释异丙酚引起的细胞凋亡。细胞凋亡主要通过内源性或者外源性途径。内源性途径通过下调抗凋亡bcl-2蛋白家族,比如bcl-xL,增加细胞线粒体通透性,使细胞色素C释放,激活caspase-9和caspase-3,导致凋亡损害。外源性通路由死亡受体激活,形成死亡受体复合物,包含Fas、TNF-α超家族,死亡受体复合物激活caspase-8,最后激活caspase-3,诱导凋亡,那么异丙酚引起细胞凋亡的原因是什么,它是通过何种凋亡途径引起的,基于此,我们体外培养大鼠胚胎神经干细胞,用Brdu法观察了异丙酚对胚胎神经干细胞增殖的影响,采用细胞流式技术观察了不同浓度异丙酚对细胞凋亡的影响,同时提取蛋白通过westernblot检测细胞凋亡通路上的几个关键蛋白细胞色素c、caspase-3、caspase-8、caspase-9,从而探讨异丙酚引起神经细胞凋亡通路,为寻找相应的靶点,阻断细胞凋亡通路,减轻异丙酚神经毒性作用打下基础。　　 已经有研究表明干预GABA受体和NMDA受体可以引起神经增殖改变,而麻醉药的作用受体主要为GABA受体和NMDA受体。因此,麻醉药对发育中大脑毒性反应除引起凋亡外,也可能对神经增殖产生影响。Stratmann等证实7日龄使用3.5％异氟醚,发现齿状回神经增殖减少至少持续4天以上,并导致永久的神经功能损害,而这种现象并没有在出生60天幼鼠发生。异丙酚作为临床上常用的静脉全麻药,除了对发育中大脑神经有促凋亡作用,那么对于发育中大脑神经增殖有没影响呢?近来,许多学者对海马齿状回神经干细胞及其子代细胞生成早期(前4周)的神经元电生理特性进行了研究,发现前体细胞在早期尚未具备自发性或者诱发突触后电位之前即被GABA激动,并可进一步激活局部神经元之间的GABA电流。在前体细胞分化为粒状神经元后,新生细胞开始接受突触GABA内向电流,一周后开始接受谷氨酸内向电流。Ge等采用shRNA下调新生神经元的Na+-K+-2CL-转运体,发现GABA介导的突触联系的形成,并且会损害新生神经元树突的发育,提示GABA介导的去极化对于新生神经元的成熟和功能具有重要的作用。在突触形成期给于麻醉药不仅影响神经前体细胞增殖,还影响存活和整合到回路中,而异丙酚作用靶点主要为GABA受体,因此,也将可能对神经前体细胞的增殖和发育产生影响。侧脑室下带和海马齿状回是神经发生的两个重要区域,对学习和记忆有着重要的功能,异丙酚对海马齿状回神经增殖产生影响也可能影响成年后认知功能。　　 体内外的研究结果提示,神经营养因子BDNF、EGF和bFGF能够促进神经元的再生。BDNF是神经营养素家族的重要一员,主要分布于大脑皮质、海马、基底前脑、纹状体等胆碱能神经元中。研究表明,BDNF不仅在中枢神经系统发育过程中对神经元的生存、分化、生长和维持神经元正常的生理功能起关键作用,而且还可以通过前胆碱能神经系统对学习记忆发挥作用,并且可以调节突触传递易化。BDNF的营养神经和促进轴突生长的作用是通过与其特异性的高亲和力受体TrkB结合而发挥的。有研究报道全麻抑制神经存活及轴突发育所需的神经营养因子,比如脑源性营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT-3)。米卫东等报道腹腔注射50mg/kg以上剂量异丙酚对缺血性脑损伤沙土鼠海马神经元增殖有抑制作用,可能的原因为减少BDNF及作用受体TrkB蛋白含量有关。　　 那么异丙酚作为临床上常用的静脉全麻药,对发育中大脑神经增殖有没影响呢?如果有影响,那么是增强还是抑制?与剂量、时间有无关系?影响的作用机制是怎样?对成年后学习、记忆能力有没影响?基于此,本研究选用出生后7天的wistar幼鼠,分单次或者重复注射异丙酚,用Brdu染色观察对海马神经干细胞增殖的影响,同时检测与神经干细胞存活有关蛋白BDNF的表达,探讨可能的机制,用Morris水迷宫实验观察异丙酚重复镇静对成年后大鼠空间学习能力的影响,进一步明确成年后行为功能与增殖之间的关系,进一步探讨异丙酚在产科和儿科手术使用的安全性,从而更好的指导其在婴幼儿中的运用。　　 第1部分异丙酚对鼠发育中大脑神经干细胞增殖及幼鼠成年后空间学习记忆能力的影响　　 1.方法:　　 1.1.异丙酚麻醉ED95测定　　 选择7日龄wister幼鼠,随机分为40、60、80、100mg/kg异丙酚剂量组。腹腔注射5分钟后测甩尾反射,然后在各组异丙酚剂量的对数值与甩尾反射阴性率之间建立回归方程,根据概率单位法计算异丙酚使95％实验幼鼠对伤害性刺激无甩尾反射所需异丙酚剂量即ED95。　　 1.2.血气分析　　 为了排除缺血、缺氧引起的神经细胞损害,选择20只7日龄幼鼠,分为异丙酚组与对照组,每组10只,分别测定异丙酚100mg/kg处理组与对照组的动脉血气,检测PH、PCO2、HCO3-、PO2。　　 1.3.单次异丙酚给药对神经干细胞增殖的影响　　 将同窝出生的7日龄幼鼠40只随机分为数量平均的四组,每组10只。各组分别腹腔注射生理盐水10ml/kg、脂肪乳剂10ml/kg、异丙酚50mg/kg、异丙酚100mg/kg,然后腹腔注射300mg/kg Brdu,12h后灌注切脑片做Brdu免疫组化。　　 1.4.重复异丙酚给药对神经干细胞增殖的影响　　 将同窝出生的7日龄幼鼠64只随机分为数量平均的四组,每组16只。各组分别腹腔注射生理盐水10ml/kg、脂肪乳剂10ml/kg、异丙酚50mg/kg、异丙酚100mg/kg,连续注射7天,第7天腹腔注射300mg/kg Brdu,12h后每组取10只灌注切脑片做Brdu免疫组化,6只取海马提蛋白westerblot检测BDNF。　　 1.5.重复异丙酚给药对成年后学习记忆的影响　　 将同窝出生的7日龄幼鼠20只随机分为生理盐水组10ml/kg、异丙酚100mg/kg两组,每组10只。各组均为腹腔注射,连续注射7天,麻醉苏醒后放回母鼠饲养,饲养两月成年后行Morris水迷宫实验观察其空间学习和记忆能力。　　 2.结果:　　 2.1异丙酚麻醉剂量ED95　　 各组幼鼠给药后鼻唇,趾端肤色红润,无发绀,呼吸频率稍偏慢。在各组异丙酚的对数剂量(Y)与甩尾反射阴性率相对的概率单位(X)间建立直线回归方程:Y=0.103x+1.292,查反对数表得到使95％甩尾反射阴性率的异丙酚剂量为:94.48mg/kg,幼鼠异丙酚麻醉剂量ED95为94.48mg/kg。　　 2.2血气分析结果　　 异丙酚组血气分析结果与对照组没有显著差异,其中异丙酚处理后PH略有下降,但没有统计学意义(t=1.622,P=0.122)；PO2在两组间比较没有显著差异(t=1.541,P=0.141)；PCO2在异丙酚处理后稍升高,但没有统计学意义(t=-1.397,P=0.179)；两组间的HCO3-没有显著差异(t=-1.510,P=0.148)。　　 2.3异丙酚单次注射后对鼠海马齿状回颗粒下区BrdU阳性细胞的影响　　 各组新生鼠的海马齿状回颗粒下区均可见一些分布不均匀,形状不规则的BrdU染色阳性的棕色颗粒,这些棕色颗粒即为新生的神经元前体细胞。四组之间BrdU染色阳性细胞数没有显著差异(F=1.009,P=0.391)。　　 2.4异丙酚重复注射后对鼠海马齿状回颗粒下区BrdU阳性细胞的影响　　 各组新生鼠的海马齿状回均可见一些分布不均匀,形状不规则的BrdU染色阳性的棕色颗粒,这些棕色颗粒即为新生的神经元前体细胞,四组Brdu阳性细胞数有显著差异(F=250.84,P=0.000),其中对照组与脂肪乳剂组没有差异(P=0.380),与对照组相比,异丙酚处理组Brdu阳性细胞数有显著差异(p=0.000),其中异丙酚100mg/kg组Brdu阳性细胞数又明显少于异丙酚50mg/kg组(p=0.000)。　　 2.5 Morris水迷宫结果　　 分别比较对照组和异丙酚组大鼠的逃逸潜伏期及平台象限游泳时间占总游泳时间比值,水迷宫训练2天后即第三天大鼠逃避潜伏期缩短,但两组逃逸潜伏期开始出现显著差异(P=0.000),与对照组相比,异丙酚100mg/kg组潜伏期延长。在第五天空间搜索能力测试中,异丙酚组在平台象限游泳时间占总游泳时间比值明显低于对照组,差异有统计学意义(P=0.000)。　　 2.6异丙酚重复注射后对大鼠海马BDNF蛋白含量的影响　　 为了检测重复注射异丙酚对海马BDNF蛋白含量的影响,应用免疫印迹法检测BDNF。以BDNF条带灰度数值比β-actin条带灰度数值所得百分数为结果数值。方差分析结果显示各组间均数存在显著性差异(F=50.958,P=0.000),对照组与脂肪乳剂组BDNF含量最高,两组相比没有统计学差异(P=0.538),与对照组相比,异丙酚组含量明显减少(p=0.000),其中100mg/kg异丙酚组含量又明显少于50mg/kg异丙酚组(P=0.007)。　　 3.结论:　　 1)异丙酚麻醉新生鼠的ED95为94.48mg/kg。腹腔注射100mg/kg异丙酚麻醉后与麻醉前动脉血气无显著差异。　　 2)与对照组相比,异丙酚单次给药后海马齿状回BrdU阳性细胞数无显著差异,但重复给药7天后海马齿状回BrdU阳性细胞数则显著减少(P<0.05)。　　 3)成年后Morris水迷宫测试显示,异丙酚组幼鼠从第三天逃逸潜伏期显著高于对照组(P<0.05),而平台像限游泳时间占总游泳时间百分数则显著短于对照组(P<0.05)。　　 4)反复注射异丙酚组的BDNF蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05)。　　 第2部分异丙酚对鼠胚胎神经干细胞凋亡影响及作用机制研究　　 1.方法:　　 选择孕14-16d Wistar大鼠,分离培养胚胎神经干细胞,取第2代神经球贴壁培养24 h后进行神经干细胞标记蛋白Nestin免疫荧光法染色鉴定,分别用5,25,50和100μmol/L的异丙酚进行处理,并同时设立脂肪乳剂组和空白对照组,添加Brdu培养24h后采用免疫组化法标记BrdU阳性细胞,DAPI复染细胞核；采用MTT法检测细胞存活率；流式细胞术观察异丙酚对胚胎神经干凋亡的影响；然后提取对照组、脂肪乳剂组、50μmol/L异丙酚、50μmol/L异丙酚+caspase抑制剂培育12小时后的全细胞蛋白,用Western—blot检测激活的细胞色素c、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表达。数据处理采用单因素方差分析,P值<0.05认为存在统计学差异。　　 2.结果:　　 2.1胚胎神经干细胞分离培养及鉴定　　 胚胎神经干细胞分离培养后第二天长成大小不一的神经球,悬浮在培养液中,传代后神经球生长速度逐渐减慢。取第2代神经球贴壁培养24 h后进行神经干细胞标记蛋白Nestin免疫荧光法染色,将同一个培养皿中总细胞和阳性细胞计数后计算百分比作为该次实验结果。Nestin阳性的培养的神经干细胞占所有培养细胞的比例维持在90.36～93.90％。　　 2.2异丙酚对胚胎神经干细胞增殖的影响　　 空白对照组、脂肪乳剂组、5、25、50和100μmol/L异丙酚处理组的细胞进行BrdU的掺入和免疫细胞荧光检测,每次实验将48孔板的5个复孔中分别随机取两个视野的所有阳性细胞数与总细胞数相比后得到的百分比数作为该组的实验结果,统计结果显示各组间不存在显著性差异(F=0.462,P=0.802),LSD法多重比较结果显示异丙酚处理组间没有差异,并不随浓度改变而改变。　　 2.3 MTT结果　　 每次实验将96孔板的5个复孔中每个孔的MTT检测数值与对照组所有MTT值的平均值相比后得到的百分比数,即标准化值作为该孔的实验结果。培养的胚胎神经干细胞数在处理后各组间存在显著性差异(F=3.584,P=0.015),LSD多重比较结果显示空白对照组和脂肪乳剂组无显著性差异,5-100μmol/L异丙酚处理24小时后细胞存活率下降,随浓度升高而下降。　　 2.4流式细胞术检测凋亡结果　　 培养的胚胎神经干细胞凋亡率各组间存在显著性差异(F=247.733,P=0.000),空白对照组和脂肪乳剂处理12小时后凋亡率无显著性差异(P=0.900),但与异丙酚组有显著差异(P=0.000),异丙酚处理组细胞凋亡率随浓度升高逐渐升高,到50μmol/L浓度时达到最高峰,100μmol/L时细胞死亡率超过凋亡率。添加了caspase抑制剂的50μmol/L屏丙酚凋亡率显著少于50μmol/L屏丙酚(P=0.000)。　　 2.5异丙酚对胚胎神经干细胞凋亡通路上关键蛋白的影响　　 1)异丙酚提高培养的胚胎神经干细胞caspase-3水平　　 空白对照组、脂肪乳剂组、50μmol/L异丙酚、50μmol/L异丙酚+caspase抑制剂培育12小时后提取蛋白做激活的caspase-3免疫印迹,方差检验结果显示组间均数存在显著性差异(F=47.495,P=0.000),50μmol/L屏丙酚组caspase-3条带灰度值显著高于脂乳剂组与空白对照组(P=0.000),添加抑制剂后激活的caspase-3含量显著降低(P=0.000)。　　 2)异丙酚提高培养的胚胎神经干细胞Cytochrome C水平　　 空白对照组、脂肪乳剂组、50μmol/L异丙酚、50μmol/L异丙酚+caspase抑制剂培育12小时后提取蛋白做Cytochrome C免疫印迹,方差检验结果显示Cytochrome C含量组间存在显著性差异(F=114.717,P=0.000),50μg/mL异丙酚提高了Cytochrome C的水平,灰度值显著高于脂肪乳剂组与空白对照组(P=0.000),但添加抑制剂后Cytochrome C的含量减低,与未添加组相比有统计学意义(P=0.000)。　　 3)异丙酚提高培养的胚胎神经干细胞caspase-9水平　　 空白对照组、脂肪乳剂组、50μmol/L异丙酚、50μmol/L异丙酚+caspase抑制剂培育12小时后提取蛋白做激活的caspase-9免疫印迹。条带灰度值分析结果显示组间均数存在显著性差异(F=135.975,P=0.000),与脂肪乳剂组与空白对照组相比,50μg/mL异丙酚组caspase-9表达水平显著提高(P=0.000),添加抑制剂后激活的caspase-9的表达水平下降(P=0.000)。　　 4)异丙酚提高培养的胚胎神经干细胞caspase-8水平　　 空白对照组、脂肪乳剂组、50μmol/L异丙酚、50μmol/L异丙酚+caspase抑制剂培育12小时后提取蛋白做激活的caspase-8免疫印迹。方差检验结果显示组间均数存在显著性差异(F=9.225,P=0.006),脂肪乳剂组caspase-8表达水平高于对照组(P=0.025),异丙酚提高了caspase-8的水平,灰度值明显高于脂肪乳剂组与空白对照组(P>0.05),添加抑制剂后caspase-8的激活水平比未添加抑制剂异丙酚组显著降低(P=0.009)。　　 3.结论:　　 1)培养的海马神经干细胞Nestin阳性比例维持在90.36～93.90％。　　 2)不同浓度异丙酚对胚胎神经干细胞增殖没有影响,但能降低细胞的存活率,其效应呈剂量依赖型。　　 3)异丙酚能引起胚胎神经干细胞凋亡,其效应呈剂量依赖型,100μmol/L异丙酚处理后细胞死亡率大于凋亡率。　　 4)异丙酚处理后的胚胎神经干细胞激活的caspase-3、CytochromeC、caspase-9 caspase-8蛋白表达水平显著增加。　　 总结:　　 本研究分别以培养的胚胎神经干细胞和出生后7日龄新生鼠为模型,观察了异丙酚对神经干细胞增殖和调亡的影响、可能的分子机制以及对成年后学习记忆的影响。在体外,异丙酚主要是通过激活caspase依赖的内源性和外源性途径引起胚胎神经干细胞凋亡；在体内,反复注射异丙酚可能是通过降低BDNF蛋白表达抑制海马神经干细胞增殖,并损害幼鼠成年后的学习记忆能力。