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胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，也是人类恶性肿瘤中，恶性程度最高的肿瘤之一。传统的治疗方式，包括手术，化疗及放疗并不能很好地控制胶质瘤的进展，在治疗后极易复发，且平均生存期很短，因此，寻求新的治疗方式是攻克胶质瘤必不可少的方向。经过多年的积累，免疫学治疗在肿瘤治疗的临床前阶段已获得了巨大的进展。模式识别受体作为人体免疫系统的前哨，通过识别来自病原体的病原体相关分子模式（PAMP），在整个免疫过程中发挥着极其重要的作用。而在肿瘤治疗中，模拟诸如病毒核酸等刺激模式识别受体，同样可以激活机体免疫系统并杀伤肿瘤细胞。人工合成的病毒核酸类似物Poly（I:C）是目前抗肿瘤免疫治疗制剂中最受关注的对象之一，被广泛地应用为肿瘤疫苗佐剂和单独的治疗制剂。Poly（I:C）最早被认为作用于Toll样受体（一种主要的模式识别受体）中的TLR3，并通过TRIF介导的分子通路刺激免疫细胞和肿瘤细胞产生干扰素和其他细胞因子，从而激活免疫系统。后来的研究证实，除TLR3外，模式识别受体中的RIG-I和MDA5也可以接受Poly（I:C）的刺激并在免疫细胞和肿瘤细胞中产生包括生成干扰素、细胞因子和诱导肿瘤细胞凋亡等一系列的生物学效应。然而，这些作用在不同类别的肿瘤之间存在一定的复杂性，并且在整个胶质瘤治疗领域中，其具体作用和作用机制尚不清楚。目的明确双链RNA类病原体相关分子模式Poly（I:C）在胶质瘤细胞中诱导肿瘤细胞产生IFN-β的效果及作用机制，及Poly（I:C）对胶质瘤细胞的直接杀伤作用，从而为扩展Poly（I:C）在胶质瘤免疫治疗的应用提供临床前的理论基础。方法1.流式细胞仪检测Poly(I:C)作用靶点TLR3在多种胶质瘤细胞系（NB19、U251、U87、SHG44、 LN-118、 U118MG）中细胞膜和细胞内的表达情况。2.脂质体2000（Lipofectamine2000）负载3种双链RNA（Poly(I:C)、5’ppp-dsRNA、 Poly（A:U））及6种双链DNA（ISD、HSV-60Naked、VACV-70Naked、Poly（dG:dC）-Poly（dG:dC）、Poly（dA:dT）-Poly（dA:dT）、 Poly（dA:dT））分别对胶质瘤细胞（SNB19和U251）、人肝癌细胞系（HepG2）、人宫颈癌细胞系（Hela）、人胃癌细胞系（MKN1和SGC-7901）和人肺癌细胞系（A549）进行细胞内转染。3. Real-time PCR检测IFN-β、IL-6、TNF-a、CXCL10、CCL-5、TRIF、STING、RIG-I及IPS-1的mRNA表达水平。4. ELISA检测细胞分泌IFN-β蛋白水平。5.利用慢病毒载体负载相应shRNA沉默TRIF、STING、RIG-I及IPS-1的mRNA表达。6. MTT法检测胶质瘤SNB19细胞生长情况。7.流式细胞仪Annexin V-PI法检测细胞凋亡及细胞周期阻滞。结果1. TLR3在胶质瘤细胞中的表达：经流式细胞仪分析，在SNB19、U251、U87、SHG44、LN-118和U118MG细胞系的细胞膜，TLR3仅有微弱的表达，而在上述细胞系内内部，TLR3均有较强表达。2.双链核酸类PAMPs刺激对胶质瘤及其他肿瘤细胞IFN-β表达的上调作用：经脂质体2000负载并转染24h，双链RNA中的Poly（I:C）在5.0μg/ml浓度下可刺激胶质瘤细胞（SNB19和U251）、人肝癌细胞系（HepG2）、人宫颈癌细胞系（Hela）、人胃癌细胞系（MKN1和SGC-7901）和人肺癌细胞系（A549）的IFN-β mRNA水平上调48.8倍、57.1倍、208.7倍、245.0倍、305.6倍、57.3倍及773.7倍。而双链DNA中的Poly（dA:dT）则可分别刺激上述细胞IFN-β mRNA水平升高29.5倍、44.3倍、15.9倍、26.5倍、14.6倍、7.2倍和115.7倍。Poly（I:C）与Poly（dA:dT）刺激胶质瘤细胞SNB19IFN-β mRNA上调均为正性剂量依赖性。ELISA检测下证实，5.0μg/ml Poly（I:C）与Poly（dA:dT）可分别刺激SNB19细胞向培养液上清分泌IFN-β蛋白，刺激24h后IFN-β蛋白浓度分别为130.854pg/ml和3383.13pg/ml。其他双链RNA及双链DNA均无法刺激SNB19细胞分泌IFN-β蛋白。3. Poly（I:C）和Poly（dA:dT）诱导SNB19细胞分泌细胞因子及趋化因子：5.00μg/mlPoly（I:C）脂质体2000转染并刺激24小时，SNB19细胞IL-6、TNF-a、CCL-5及CXCL-10mRNA表达水平可升高至24.54倍、759.78倍、88925.77倍和17.46倍。同浓度下Poly（dA:dT）则可刺激IL-6升高16.29倍，而在2.5μg/ml浓度时刺激TNF-a、CCL-5及CXCL-10作用最为明显，分别使其升高503.5倍，339634.24倍及85.75倍。Poly（I:C）与Poly（dA:dT）刺激SNB19细胞L-6、TNF-a、CCL-5及CXCL-10mRNA表达水平上调均成正性计量依赖性趋势。4. Poly（I:C）及Poly（dA:dT）对胶质瘤细胞诱导IFN-β表达的机制研究分别对SNB19细胞进行STING、RIG-I、IPS-1及TRIF的mRNA干涉，干涉后脂质体2000负载Poly（I:C）刺激SNB19细胞IFN-β mRNA上调程度干扰率（与未干涉对照组相比）分别为：RIG-I（52.0%）、IPS-1（68.21%）、TRIF（14.62%）。 Poly（dA:dT）则为：RIG-I（38.8%）、IPS-1（50.22%）、STING（-1.28%）。5. Poly（I:C）和Poly（da:dt）诱导胶质瘤细胞凋亡的作用：经脂质体2000负载的Poly（I:C）及Poly（dA:dT）在2μg/ml浓度下刺激SNB19细胞24小时可明显抑制肿瘤细胞生长，浓度增至5μg/ml后生长抑制更为明显。不经脂质体2000负载，则两种核酸均不能引起SNB19细胞的生长抑制。MTT实验可证实上述生长抑制效应的剂量依赖性。Annexin V法检测细胞凋亡示SNB19细胞在经脂质体2000负载的Poly（I:C）与Poly（dA:dT）作用下，早期凋亡及晚期凋亡均随药物剂量及作用时间的增加而增加。细胞周期分析显示两者均可使SNB19细胞发生S期阻滞。同样，不经脂质体2000负载，两种核酸则无法引起上述效应。结论1.本研究发现，在胶质瘤细胞系中，TLR3主要表达于细胞胞内。2.实验结果证实，经过脂质体2000负载转染至胞内，Poly(I:C)在多种肿瘤细胞系中均有较强的刺激肿瘤细胞生成IFN-β及其他细胞因子和趋化因子的能力；本研究首次在双链DNA类PAMPs中确认了Poly（dA:dT）在诱导胶质瘤产生细胞因子及趋化因子方面与Poly（I:C）的相似作用方式3. Poly（I:C）对胶质瘤细胞的作用并不主要通过TLR3进行，而是通过激活胶质瘤细胞胞浆中的RIG-I/IPS-1通路，从而诱导胶质瘤细胞产生包括IFN-β在内的多种细胞因子。Poly（dA:dT）的作用机制并非主要通过激活肿瘤细胞内的DNA感受器STING，而是同样通过激活RIG-I/IPS-1通路。4.本研究证实了通过脂质体2000作为载体胞内转染Poly（I:C）与Poly（dA:dT）对胶质瘤细胞有着较强的促凋亡作用，并且可诱导SNB19胶质瘤细胞产生S期阻滞。单纯胞外作用则无法发挥上述作用，提示这一过程同样需要双链核酸进入细胞内部进行。综上所述，通过利用脂质体作为给药途径，Poly（I:C）和Poly（dA:dT）具有作为胶质瘤免疫治疗药物的潜力。