心血管疾病,尤其是动脉粥样硬化及冠心病是发达国家与部分发展中国家人口多年来居于首位的死亡原因。流行病学研究表明,绝经前的女性得动脉粥样硬化的比例显著低于同年龄的男性,而这种差别在绝经后却大大减小,甚至略高于男性。现代医学普遍认为,这种改变很可能是通过荷尔蒙调节的并且与绝经时雌激素水平的降低有关。临床医学亦证实,雌激素可降低心血管疾病的发病率及死亡率。与此相一致,17p-雌二醇(17β-estradiol, E2),作为最主要的一种内源性的雌激素,也在各项研究中表现出防止动脉粥样硬化的作用。雌激素可以从各个方面调节血管功能,其中尤以改变心血管风险因子并抑制生长因子诱导的平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的增殖与迁移受到广泛关注。因为血管平滑肌的增殖与迁移在促进动脉粥样硬化的过程中起了重要的作用,尤其是早期斑块的形成过程。但是,具体的雌激素介导的血管保护机制依旧不清楚。过氧化物酶体增殖子活化受体γ共激活因子-1α(PGC-1α),即PPARGC-1α (PPARy coactivator-1α),属于PGC-1 (PPARy的辅激活因子)家族。PGC-1α作为共转录激活因子的代表,广泛分布于褐色脂肪组织,骨骼肌,肝脏,肾脏与脑中,能够刺激线粒体生成,调节脂代谢并激活一些核受体及转录因子,在调控细胞能量代谢方面起了重要的作用。PGC-1α具有信号诱导特异性、组织表达特异性、生理学功能多样性和调节途径多样性四大特点,随着研究的深入,它作为转录共激活因子根据外界刺激调控生理活动的典型例子,已被发现在越来越多的疾病调控中发挥重要的作用,如肥胖,糖尿病和心肌病。我们实验室前期研究发现PGC-1α能够调控自由脂肪酸诱导的平滑肌细胞病理学增殖和心血管疾病的风险。其中,油酸,作为血浆中重要的不饱和脂肪酸油酸,是自由脂肪酸中的重要作用成份,它能够降低大鼠VSMC中PGC-1α的表达,从而诱导胞外调节蛋白激酶依赖的有丝分裂反应来导致VSMC异常增殖与迁移,而上调PGC-1a几乎能够完全抑制油酸诱导的VSMC的生长。PGC-la作为通用的辅激活因子,可辅助激活一系列核受体,包括PPARy, PPARa,甲状腺素受体(TR),糖皮质激素受体(GR),雌激素受体(ER),视黄醇X受体(RXR)等的基因表达。雌激素主要通过与受体(ER)结合来发挥其生理学功能,研究证据显示PGC-1α可以作为配体,与ER作用,从而发生互相调节的关系。此外,最近的研究表明在心脏中E2能够通过上调PGC-1a的表达来恢复心肌功能。但是,PGC-1a是否在雌激素介导的血管保护作用中也有类似的作用并不知道。包外调节蛋白激酶1/2 (Extracellular signal-regulated kinasel/2, ERK1/2, is sometimes as a synonym for MAPK)包括ERK1和ERK2,统称为ERK1/2。ERK1/2的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键,信号通路(Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2)是经典的MAPK信号转导途径。平时ERK1/2位于胞浆内,一旦被激活,ERK1/2迅速穿过核膜,活化的ERK1/2可磷酸化多种核转录因子如Elk-1、Ets-1、c-Myc、Sapla、Tal、STAT、Fos、ATF2、Max、 c-jun及ATF2等,这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转录,引起特定蛋白的表达或活性改变,最终调节细胞代谢和功能,影响细胞产生特定的生物学效应。有研究表明,氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导的VSMC增殖作用可能与调节G蛋白偶联受体,启动Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2通路有关。另外,最近Fisher等观察到了ERK1/2反义寡核苷酸(ODNs)对VSMC增殖和(或)迁移的抑制作用,因而认为在细胞外基质(ECM)所诱导的VSMC迁移和增殖过程中,ERK1/2是发挥了重要作用的关键信号分子。ERK1/2能够被各种生长因子、离子射线、过氧化氢、血清及佛波酯等外界刺激而激活。能够被很多刺激因子激活,包括油酸(oleic acid,OA)。 ERK1/2磷酸化能够刺激很多蛋白和转录因子,例如elk-1和ets-1,能够激活c-fos和MMP-9进而导致平滑肌的增殖与迁移。在我们的研究中,检测了在OA刺激的条件下雌激素对平滑肌生长的抑制作用。为了进一步了解其分子机制,我们研究了PGC-1α与E2之间是否存在潜在的调控关系,可以为雌激素的血管保护作用提供了新的分子研究基础。以上是第一部分的研究概述,其中,在研究PGC-1α基因的过程中使用了干扰RNA的方法,我们知道通过干扰基因的表达不仅是基础研究中了解基因功能的一个强有力的工具,而且也可以作为很有潜力的治疗疾病的手段。下面一部分我们的研究就集中在另一种基因干扰的方法上,利用用核糖核酸酶P(RNase P)所具有的切割活性来达到抑制靶向RNA表达的目的,并且重点研究了如何有效运送干扰片段的方法。巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)是疱疹病毒家族的成员之一。该家族其他成员还有herpes simplex virus 1 (HSV-1)和Epstein-Barr病毒。CMV是造成新生儿智障的首要原因,并且会使免疫力低下的病人,包括AIDS患者,产生可能致死的并发症。CMV的抗药株的出现使得我们有必要发展新的抗病毒试剂和治疗手段。巨噬细胞和它们的祖细胞,比如单核细胞,是CMV的主要宿主细胞,CMV可以在这些细胞中建立原发感染或者潜伏感染。因此,在巨噬细胞中阻碍CMV的感染和复制是治疗和防止CMV相关疾病的中心要诀。由于该病毒无法在非人类细胞中传播,目前还缺少完全模拟人类CMV感染的合适的动物模型。小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染小鼠过程在发病机理方面类似于人类感染CMV,因而它是研究CMV in vivo感染的绝佳的动物模型,并且可用于筛选新药和发展新的治疗策略。以核酸为基础的基因干扰技术,包括核酶和小干扰RNA (siRNA),由于其可以特异性地抑制选定的mRNA序列,因而是很有前途的基因靶向性策略。例如,siRNA可以在体内和体外有效地诱导RNA干扰(RNAi)通路去阻断基因表达。Altman及其同事在之前的文献中发现了Escherichia coli包含有催化活性RNA亚基(M1 RNA),而这一发现可以用来设计序列特异性的核酶(MIGSRNA)(图1 A-B)。体外实验中,M1GS RNA可以高效地切割目标细胞／病毒]mRNA,并且阻断相应基因在细胞中的表达。以M1GS为基础的策略是一种独特的核酸干扰手段,因为它使用了自然界中可以找到的最高效的催化性RNA, M1RNA.使用核酸机制的基因干扰手段来进行基因治疗的最基本的难题就是用一种组织／细胞特异、高效并且安全的手段将基因干扰试剂送入正确的细胞。很多正在用的载体是基于减低毒性或者修饰的病毒,或者由DNA,蛋白和／或脂质组成复合微粒的人工载体。组织特异性的载体只在使用靶向某些细胞类型的运输工具时有过部分的成功。因而,在体内高效和靶向地输送M1GS序列去特定的组织或者细胞类型是研发以此技术进行基因靶向治疗的中心问题。侵入型细菌,比如.Salmonella,拥有进入人类细胞并且转运基因物质的能力,可以引发被转运基因的高效表达。有文献显示减毒的Salmonella菌株可以用作运送核酸疫苗和抗肿瘤转基因的运输系统。在这些研究中,包含了真核启动子控制的转基因的质粒,被转入Salmonella中。尽管细菌载体的质粒DNA是如何转移到宿主中的基质并不完全清楚,但是这些减毒的菌株确实可以靶向特定的细胞,比如树突状细胞,巨噬细胞,以及上皮细胞,引起高效的转基因表达。Salmonella为基础的载体造价较低,并且易于制备。此外,它们可以用于体内实验的口服给药,这是一种非入侵式的给药途径,好处显著。因此,Salmonella作为基因治疗的运输载体很有前途。巨噬细胞是Salmonella在体内分散后的主要宿主,因此,它被视作Salmonella基因治疗的理想靶标。然而目前还没有Salmonella可以有效运送核酶(比如RNase P核酶)在动物体内表达的报道。同样不清楚的是是否Salmonella运送的核酶能否在体内发挥抑制基因表达的功能。在我们的研究中,我们构建了一个新的Salmonella减毒菌株,SL101。这种新的菌株展现了高基因转移活性和低细胞毒性／病原性。我们使用MCMV感染的小鼠作为模型,研究显示在动物中口腔接种SL101可以有效地将RNase P为基础的核酶序列运输到特定的器官,引起核酶的大量表达并且有效地抑制病毒感染和发病。我们构建了M1GS核酶,它的靶标是编码MCMV蛋白M80.5的mRNA。M80.5的编码序列是完全包含在病毒蛋白酶(protease, PR)的3’编码区内的。因此,我们的核酶应该会同时靶向M80.5和PR,这两个蛋白对于MCMV的衣壳组装和复制是至关重要的。这些结果提供了第一个直接证据证明了Salmonella载体运送的核酶表达可以在动物中非常高效地阻碍病毒感染。除此以外,这些结果展现了使用Salmonella协助口服运送RNase P核酶,作为通用的体内基因靶向治疗方式的可行性。