蒺藜苜蓿是豆科一年生草本植物,具有倍性小、基因组小、自花受粉及结种较多等特点。蒺藜苜蓿的植株再生时间较短,具有较高的遗传转化效率,因此其作为一种模式植物被国内外实验室广泛使用。豆科植物与根瘤菌形成的共生固氮系统是自然界重要的固氮方式之一,豆科植物供给根瘤菌碳水化合物,根瘤菌供给植物氮素养料,从而形成互利共生关系。其本质是一种极其复杂的分子对话行为,其中涉及到一系列豆科植物体内基因的调控表达过程,因此研究与根瘤结瘤固氮相关的基因如何进行表达调控具有重要意义。本实验室前期利用RNA-Seq对蒺藜苜蓿结瘤根进行研究,发现Medtr3g079850、Medtr8g089360不在发根中表达,只在根瘤中特异表达。推测其在结瘤过程中起到重要的调控作用且可能对蒺藜苜蓿共生固氮产生影响。通过序列比对分析,Medtr3g079850基因推测来自receptor-like protein kinase(受体样蛋白激酶)家族,Medtr8g089360基因推测来自cationic amino acid transporter(阳离子氨基酸转运蛋白)家族。为进一步探究上述基因在蒺藜苜蓿结瘤过程中的影响,本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除所选基因,观察统计敲除发根与空载发根的表型差异,以及对蒺藜苜蓿结瘤过程的影响,通过qRT-PCR法研究了目的基因在蒺藜苜蓿结瘤过程中的动态表达特征,利用GUS染色确定所选基因翻译产物在根瘤中的表达部位,研究结果将为探明上述基因在蒺藜苜蓿与根瘤菌共生互作过程中所行使的具体功能打下良好基础。本实验主要研究内容及结果如下:构建了Medtr3g079850、Medtr8g089360两个基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体;应用发根农杆菌介导的植物受体转化技术,将构建的CRISPR/Cas9基因敲除载体分别导入蒺藜苜蓿,接种根瘤菌后,观察其对蒺藜苜蓿根瘤生长发育的影响。结果显示Medtr3g079850、Medtr8g089360基因被敲除后,与导入空载体的对照组相比敲除发根长度明显减少,结瘤能力减弱,根瘤数量减少,有效根瘤数减少,根瘤小且白。利用qRT-PCR研究了目的基因在蒺藜苜蓿根瘤生长过程中的动态表达特征,发现Medtr3g079850主要在结瘤前期表达;Medtr8g089360在根瘤发育全过程中表达。构建了连有Medtr8g089360基因启动子的GUS表达载体,利用GUS染色确定所选基因翻译产物在根瘤中的表达部位,结果显示Medtr8g089360基因翻译产物主要定位于感染区。