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背景和目的:心脏骤停后脑缺血再灌注损伤是心肺复苏后脑损伤的重要病理环节。神经元细胞自噬是缺血性神经损伤的关键机制。大量的环状RNA(ciRS-7)存在神经系统,并通过miRNA-7表达影响mTOR及下游靶物-p70S6K导致神经元自噬。我们前期研究发现,参附注射液通过阻断勿动蛋白受体(Nogo1-Ng R)对神经元细胞修复功能有促进作用。但未见神经元细胞自噬对心肺复苏后脑损伤机制的研究报道,据此我们提出假说:参附注射液可能通过调节ciRS-7/miR-7/mTOR/p70S6K信号通路介导心肺复苏后神经元自噬而起到脑保护作用。本课题通过复制心脏骤停/心肺复苏后小鼠模型,用q PCR、TUNEL荧光、透射电镜、免疫组化和尼氏(NISSL)染色等检测ciRS-7/miR-7/mTOR/p70S6K信号通路;探讨心肺复苏自主循环恢复后神经元细胞自噬的机制和参附注射液的干预效应,揭示参附注射液对心肺复苏后脑缺血再灌注损伤的有效治疗靶点,为参附注射液治疗心肺复苏后脑损伤提供新的理论依据。方法:把雄性SD小鼠随机分成5组:假手术组,常规模型组,拮抗剂组(ciRS-7-KD),参附注射液组,参附+拮抗剂(ciRS-7-KD)组。除假手术组外,其余4组小鼠均通过冰氯化钾诱导小鼠发生心脏骤停,之后进行心肺复苏,建立心脏骤停/心肺复苏(CA/CPR)小鼠模型。除假手术组不用药物,其他组小鼠心肺复苏成功后1-2min经股静脉给予相应剂量药物。以3小时,24小时,3天,7天为观察点,比较各组小鼠相关指标的变化。实验主要从两个方面进行,一、动物体内实验:先从动物层面观察参附注射液对心肺复苏后小鼠的生存率和神经功能评分情况。然后,从组织和分子层面观察心肺复苏后小鼠皮质和海马中神经元自噬结构和神经凋亡情况,并明确ciRS-7/miR-7/mTOR/p70S6K相关核酸和蛋白指标的表达情况。二、体外实验,通过细胞实验证实该通路的调控。具体指标包括以下几点:1.通过CDR1as基因sh RNAAAV9型腺相关病毒包装和体内验证试验,制备ciRs-7拮抗剂。2.计算各组小鼠生存率和神经功能缺损评分评估各组神经功能受损情况。3.通过q PCR检测各组复苏后小鼠海马区各时间点ciRS-7、miR-7、mTOR、p70S6K的表达情况。4.通过TUNEL荧光染色和透射电镜观察复苏后小鼠神经细胞自噬和凋亡。5.通过q PCR、免疫组化、TUNEL检测、尼氏(NISSL)染色和透射电镜等检测,参附注射液对心肺复苏后小鼠脑组织ciRS-7/miR-7/mTOR/p70S6K信号通路的调控作用和神经细胞自噬及凋亡的影响。6.检测参附注射液对氧糖剥夺(OGD/R)PC12细胞的自噬和凋亡影响。结果:1.不同剂量的CDR1as干扰病毒分别感染小鼠,根据qPCR检测CDR1as表达结果,选择2μl病毒量作为ciRs-7拮抗剂进行脑内注射和下一步实验。2.CA/CPR心肺复苏小鼠的生存率、神经功能评分:(1)生存率:拮抗剂和常规模型组的生存率与假手术组相比,小鼠心肺复苏后第24小时和48小时的生存率明显下降(P<0.05);与常规组相比,参附组和参附+拮抗剂组的小鼠在心肺复苏成功后24小时和48小时生存率明显升高(P<0.05)。(2)神经功能评分:与常规模型组相比,拮抗剂组和参附+拮抗剂组小鼠的神经功能评分在第3天和第7天有明显升高(P<0.05),而参附组小鼠在心肺复苏自主循环恢复后24h、3d、7d神经功能评分均显著减少(P<0.05,P<0.01)3.复苏后小鼠海马区各时间点ciRS-7、miR-7、mTOR、p70S6K的表达情况(1)常规模型组和拮抗剂组(ciRS-7-KD)小鼠脑组织中ciRS-7表达在小鼠自主循环恢复3h、24h、3d、7d呈时间依赖性降低,其中3d时ciRS-7表达最低(p<0.01)。(2)常规模型组和拮抗剂组(ciRS-7-KD)小鼠脑组织中miR-7表达,与假手术组相比,常规模型组小鼠自主循环恢复3h、24h、3d的miR-7表达呈时间依赖性增加,ciRS-7-KD组小鼠脑组织中miR-7表达呈时间依赖性增加,7d时最高(p<0.05)。(3)常规模型组和拮抗剂组(ciRS-7-KD)小鼠脑组织中mTOR表达,与假手术组相比,3d均有显著升高(p<0.05)。(4)常规模型组和拮抗剂组(ciRS-7-KD)小鼠脑组织中p70S6K表达,与假手术组相比,在小鼠自主循环恢复3h、24h、3d、7d呈时间依赖性增加,拮抗剂组(ciRS-7-KD)显著增加(p<0.05)。4.心肺复苏成功后小鼠神经元细胞自噬和凋亡情况(1)通过TUNEL染色检测,与假手术组相比,心肺复苏后小鼠3d和7d常规模型组小鼠脑细胞凋亡增加;而且ciRS-7-KD组比常规模型组细胞凋亡显著增多。(2)通过透射电镜观察,与假手术组相比,心肺复苏后小鼠3d和7d常规模型组脑细胞自噬增加;而且ciRS-7-KD组比常规模型组细胞自噬增加。5.参附注射液对ciRS-7/miR-7/mTOR/p70S6K信号通路的调控作用(1)参附组小鼠24h、3d、7d相比对应时间内的常规模型组小鼠ciRS-7表达显著升高(p<0.01);而参附+ciRS-7-KD组小鼠脑组织中ciRS-7表达呈时间依赖性降低(p<0.01),7d时最低。(2)参附组小鼠24h、3d、7d相比对应时间内的常规模型组小鼠miR-7表达显著降低(p<0.01);而参附+ciRS-7-KD组小鼠脑组织中miR-7表达呈时间依赖性升高(p<0.05),7d时最高。(3)参附组24h、3d、7d相比对应时间内的常规模型组小鼠mTOR表达显著降低(p<0.01)。而参附+ciRS-7-KD组小鼠脑组织中mTOR表达呈时间依赖性升高(p<0.05),3d时最高。(4)参附组小鼠24h、3d、7d相比对应时间内的常规模型组小鼠p70S6K表达显著降低。参附+ciRS-7-KD组小鼠脑组织中p70S6K表达呈时间依赖性升高(p<0.05),7d时最高。6.参附注射液对心肺复苏后小鼠海马区神经细胞凋亡和自噬的影响(1)通过TUNEL染色L检测,与假手术组比,常规模型组小鼠脑细胞凋亡有增加;而参附组相比常规模型组细胞凋亡降低。ciRS-7-KD促进参附组小鼠脑细胞凋亡。(2)通过透射电镜观察,与假手术组相比,常规模型组小鼠脑细胞自噬增加;参附组相比常规模型组细胞自噬降低。ciRS-7-KD促进参附组小鼠脑细胞自噬。7.mTOR、p70S6K心肺复苏后小鼠在各组海马区的蛋白表达情况:通过蛋白质印迹检测,24h,各组脑皮质mTOR和P70S6K的蛋白表达明显增加,两者在拮抗组和参附+拮抗组的含量显著增多,尤其拮抗组(ciRS-7-KD)的含量明显比假手术组增多(P<0.05)。而在参附组,mTOR和P70S6K的蛋白比假手术组明显减少(P<0.05,P<0.01)。8.神经细胞自噬相关蛋白和凋亡的表达情况(1)在心肺复苏成功后24h,通过免疫组化染色法检测,与假手术组相比,常规模型组和拮抗剂(ciRS-7-KD)组海马Ca3区的LC3和Beclin-1进一步上调,P62下调。参附注射液可抑制常规模型组小鼠海马组织中LC3和Beclin-1的表达,促进P62的表达。(2)在心肺复苏成功后24h,通过尼氏(NISSL)染色观察,常规模型组神经元有缺失,排列松散;ciRS-7-KD组相比常规模型组神经元排列更为松散;参附组神经元细胞比常规模型组排列整齐,缺失减少;ciRS-7s-KD+SF组比参附组神经元排列松散,趋于缺失。9.参附注射液对氧糖剥夺(OGD/R)PC12细胞的自噬和凋亡影响(1)OGD/R组PC12细胞凋亡增加;参附注射液组相比模型组细胞凋亡降低。ciRS-7-KD及mTOR激活剂(MHY1485)促进参附注射液组PC12细胞凋亡。(2)与正常组相比,OGD/R组PC12细胞的LC3蛋白表达增加,自噬溶酶体增加;参附注射液组比模型组细胞LC3表达减少,ciRS-7-KD及mTOR激活剂(MHY1485)是促进参附注射液组PC12细胞LC3表达。结论:1.参附注射液能提高心脏骤停/心肺复苏(CA/CPR)小鼠的生存率和降低神经功能严重程度评分,对脑损伤有神经保护作用。2.通过复制心脏骤停/心肺复苏(CA/CPR)所致心脏骤停后脑损伤的小鼠模型,脑部缺血再灌注可能下调ciRS-7的表达,进而对其下游的miR-7抑制作用减弱,而上调miR-7/mTOR/p70S6K信号通路的蛋白表达,导致神经细胞自噬和凋亡的发生。3.参附注射液可能上调ciRs-7的表达,对miR-7抑制作用增强,下调下游的miR-7/mTOR/p70S6K蛋白表达,从而减少心肺复苏后小鼠神经细胞的自噬和凋亡的发生,发挥神经细胞的保护作用。为参附注射液对脑复苏的神经保护在分子层面提供新的治疗靶点。