【摘 要】
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目的: 利用分子生物学技术克隆大鼠睫状神经生长因子(CNTF)基因片段,构建腺相关病毒表达载体,为探讨CNTF 对大鼠视网膜神经节细胞的影响奠定基础。方法: 1.采用基因拼接的方
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目的: 利用分子生物学技术克隆大鼠睫状神经生长因子(CNTF)基因片段,构建腺相关病毒表达载体,为探讨CNTF 对大鼠视网膜神经节细胞的影响奠定基础。方法: 1.采用基因拼接的方法克隆大鼠CNTF 的ORF(开放读码框)DNA 片段,所得的DNA 片段经SalⅠ和XbaⅠ双酶切后定向插入腺相关病毒载体AAV-MCS质粒中构建成pAAV-CNTF。2.pAAV-CNTF 和另外两种质粒pHelper、pAAV-RC 通过脂质体共转染AAV-293 细胞,包装成带有CNTF 的重组腺相关病毒。收集病毒颗粒,同时以pAAV-LacZ 作为报告基因和pHelper、pAAV-RC 三种质粒在和pAAV-CNTF 完全相同的条件下共转染AAV-293 细胞,通过β—半乳糖苷酶染色测定转染率,收集病毒原液。以不同稀释梯度的病毒感染HT-1080 细胞,通过β—半乳糖苷酶染色测定病毒滴度。结果:1.测序证实CNTF 与GeneBank 提供的原始序列完全一致。酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致。2.藉β—半乳糖苷酶原位染色法检测报告基因LacZ 在人纤维肉瘤细胞(HT-1080)中的表达测得重组病毒滴度为7.0×10~7个∕ml。结论: 本实验成功地克隆了CNTF 基因并构建了其腺相关病毒表达载体,为进一步研究用CNTF 基因转染的方法来促进视神经损伤修复奠定了基础。
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