【摘 要】
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目的本研究应用慢病毒感染技术构建ARID1A基因沉默的人胃癌MGC-803细胞模型,探讨ARID1A基因沉默对人胃癌细胞增殖抑制的影响。方法实验分组:根据Gen Bank数据库提供的ARID1A基因序列,设计3条ARID1A靶点干扰序列,分别命名为KD1、KD2、KD3,阴性对照组(NC)。3条ARID1A靶点干扰序列引物退火形成双链DNA,与经过双酶切的线性化GV493载体连接并转化;在293T
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目的本研究应用慢病毒感染技术构建ARID1A基因沉默的人胃癌MGC-803细胞模型,探讨ARID1A基因沉默对人胃癌细胞增殖抑制的影响。方法实验分组:根据Gen Bank数据库提供的ARID1A基因序列,设计3条ARID1A靶点干扰序列,分别命名为KD1、KD2、KD3,阴性对照组(NC)。3条ARID1A靶点干扰序列引物退火形成双链DNA,与经过双酶切的线性化GV493载体连接并转化;在293T细胞中进行病毒包装并测定病毒滴度;将重组慢病毒转染人胃癌MGC-803细胞,RT-PCR和Western blot检测细胞ARID1A m RNA和蛋白表达水平。待干扰序列靶向沉默ARID1A基因,并表达稳定后,选取转染效率高的组做ARID1A基因沉默后细胞增殖,细胞周期,细胞迁移,细胞侵袭,细胞凋亡等细胞行为学的研究。结果测序结果显示,设计的干扰序列正确插入GV493载体,成功构建sh RNA-ARID1A重组载体;慢病毒载体在293T细胞完成包装,病毒滴度为8*10~8TU/m L;RT-PCR和Westen blot结果显示,慢病毒载体转染ARID1A细胞后,KD3组能显著降低ARID1A基因在m RNA和蛋白表达水平;在转染成功后,选用KD3组细胞进行细胞增殖,细胞周期,细胞迁移,细胞侵袭,细胞凋亡等细胞行为学实验。结果为沉默ARID1A后,细胞增殖实验显示,KD3组与NC组相比,增殖能力增强,其在第1天、第2天、第3天、第4天对MGC-803细胞的增殖加强作用呈时间依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期实验显示,KD3组与NC组相比,有更多的细胞进入S期,NC组进入S期的细胞占23.05%±0.09%,KD组进入S期的细胞占27.97%±0.38%,表明细胞增殖活跃,差异有统计学意义(P<0.05);细胞迁移实验显示,KD3组与NC组相比,迁移能力增加,细胞划痕24小时,NC组平均迁移率为29%±0.06%,KD组平均迁移率为47%±0.03%,差异有统计学意义(P<0.05);细胞侵袭实验显示:KD3组相对于NC组,KD3组细胞穿过数平均为187±2.51个,NC组细胞穿过数平均为110±1.52个,KD3组细胞侵袭能力明显增强;细胞凋亡实验显示:KD3组的细胞凋亡率平均为4.54%,NC对照组的细胞凋亡率平均为25%,KD3组相对于NC组,KD3组细胞凋亡作用明显降低。实验显示ARID1A基因有明显的抑制细胞增殖,细胞迁移,细胞侵袭作用;有明显的促进凋亡作用。结论在人胃癌MGC-803细胞中,靶向沉默ARID1A基因后,胃癌MGC-803细胞的增殖,迁移,侵袭能力增强;细胞凋亡行为减弱,更多细胞进入S期,细胞增殖活跃。
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