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目的:
采用形态学、分子生物学、免疫组化技术和方法观察温和灸、电针及隔药灸对CD大鼠TGF-β/Smads、ERK信号途径以及bFGF、c-fos的调控,探讨针灸对肠壁纤维化的作用机制及获效环节。
方法:
参照国际公认的Morris方法,采用TNBS多次致炎方法制备大鼠CD肠纤维化模型。将大鼠随机分为正常组、模型组、温和灸组、电针组和隔药灸组。各针灸治疗组选取天枢、气海穴分别采用不同的针灸方式进行治疗。采用Masson染色法观察针灸对CD肠纤维化大鼠结肠组织胶原纤维的影响;采用免疫组织化学法观察CD肠纤维化大鼠结肠组织细胞外基质(Ⅰ型胶原、FN)、TGF-β/Smads信号通路(TGF-β、Smad2、Smad4)ERK信号通路(Ras、Raf、MEK、ERK)、bFGF和c-fos的分布与表达及针灸对其的影响;采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测各组大鼠Smad2、Smad4、Ras、Raf.、MEK、ERK、bFGF及c-fos mRNA的表达。
结果:
1、CD大鼠出现腹泻、食欲不振、体重增长缓慢等症状体症;病理学观察可见模型组大鼠结肠各层结构被破坏,肠壁坏死,大量纤维组织增生;经治疗后,温和灸组、电针组及隔药灸组结肠肠壁结构损伤得到不同程度改善,结肠大体形态损伤和组织学损伤明显低于模型组(P<0.05或P<0.01);
2、Ⅰ型胶原、FN蛋白在正常结肠组织中微弱表达,CD肠纤维化大鼠结肠组织上述蛋白表达明显增多(P<0.01);经针灸治疗后,大鼠结肠组织Ⅰ型胶原、FN蛋白表达明显减少(P<0.01);
3、正常大鼠结肠组织上皮细胞TGF-β、Smad4蛋白表达弱阳性,Smad2表达中度阳性,CD肠纤维化大鼠结肠黏膜上皮TGF-β、Smad4表达强阳性,Smad2表达弱阳性;针灸对上述蛋白的表达均有调控作用(P<0.05或P<0.01);与Smad2、Smad4mRNA表达的变化呈相同趋势;
4、模型组结肠组织Ras、Raf,MEK、ERK的IOD及mRNA表达均显著高于正常组(P<0.01),经针灸治疗后有不同程度的降低;
5、CD肠纤维化大鼠结肠黏膜bFGF、c-Fos蛋白及mRNA表达显著增加(P<0.01),针灸治疗后bFGF、c-Fos蛋白及mRNA表达均有所降低(P<0.05或P<0.01)。
结论:
1、针灸“天枢”、“气海”可以下调CD肠纤维化大鼠结肠异常增高的Ⅰ型胶原和FN蛋白的表达,发挥抗肠纤维化的作用;
2、TGF-β/Smads信号通路是导致大鼠CD肠纤维化的主要途径之一,其中Smad4是该信号通路的关键环节之一;针灸可能通过对TGF-β、Smad2以及Smad4表达的调控发挥抗肠纤维化的作用;
3、Ras/Raf/MEK/ERK信号通路有促肠纤维化作用,针灸可能通过抑制其在CD肠纤维化大鼠肠壁组织中的表达抑制纤维化发展,从而发挥抗肠纤维化的作用;
4、bFGF参与了大鼠CD肠纤维化过程,针灸可能通过降低结肠黏膜bFGF、c-fosmRNA及蛋白表达发挥对CD肠纤维化的治疗作用。